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黄霉素为磷酸多糖类抗生素,是一种新型的抗生素类药物添加剂或促生长剂。以其高效、低毒和低残留在畜牧业上有着广阔的应用前景。本文研究的主要目的是通过对黄霉素产生菌加纳链霉菌SgWE-11菌种选育和发酵工艺优化,有望得到几株高产菌株,以不断提高黄霉素产量,为实现我国饲料工业的高效、优质和低耗做出积极的探索。
根据黄霉素的理化特性和代谢调控原理,运用紫外线、亚硝酸等诱变因子对菌种进行诱变,并结合自然分离,筛选得到抗自身代谢产物黄霉素和链霉素的高产突变株SgWE-25,发酵单位为875u/mL,比出发菌株加纳链霉菌SgWE-11提高了4.4倍。对菌株SgWE-25进行了遗传稳定性试验,自然分离5次后斜面传代5次,结果表明,该菌株具有良好的遗传稳定性。
对菌株SgWE-25孢子培养工艺进行了研究,从7种供试培养基中筛选出一种有利于SgWE-25产孢子的培养基,通过单因素实验研究了斜面培养基培养条件;然后,利用正交实验方法优化液体种子培养基的配方,通过单因素实验研究了孢子接种龄和接种量对种子生长的影响。结果表明:1.在2CM培养基上,pH值为7.0,37℃恒温培养时,菌株SgWE-25产孢子量最多,产孢子量为5.04亿个伎斜面。2.优化的液体种子培养条件为:培养基配方:豆饼粉5%,玉米粉3%,葡萄糖2.5%,蛋白胨2%,硫酸铵0.2%,MgSO<,4> 0.015%,KH<,2>PO<,4> 0.008%;孢子龄为84h,接种量为1.95亿个/50mL。在优化的培养条件下培养,种子液中DNA含量达0.553g/mL。
研究了不同碳源、氮源对发酵的影响:利用全因子试验、最陡爬坡试验和响应面法优化SgWE-25发酵培养基配方,并通过单因素实验优化了发酵培养条件。结果为:优化的发酵培养基配方:豆饼粉4.61%,玉米粉3.01%,葡萄糖0.49%,可溶性淀粉3%,硫酸铵0.2%,硫酸镁0.015%,KH<,2>PO<,4> 0.008%,CaCO<,3> 0.2%;优化的发酵条件是:摇床转速200r/min、摇瓶装量50mL/500mL、接种量6%、温度37℃、发酵周期160h、培养基初始pH为7.5。在优化的培养条件下培养,发酵液中黄霉素含量达1144u/mL。
10L发酵罐优化黄霉素的发酵工艺:搅拌速度300rpm:通气量1.5vm<-1>:培养温度37℃;发酵周期160h,需采用聚醚类消泡剂。此条件下,发酵液中黄霉素的效价可达1279u/mL。
对SgWE-25菌株10L发酵罐小试的发酵液浓缩、冷冻干燥后制得黄霉素粗品,对该粗品中黄霉素各组分进行硅胶柱层析分离提纯,生物活性跟踪和TLC分析后得到只含单一组分S2的结晶。HPLC检测该结晶和粗品,色谱图和黄霉素标品的色谱图相对照,发现S2组分为黄霉素主要组分A。