[目的]随着流行病学调查和动物学实验的揭示,铝的生物危害逐渐被发现并受到普遍关注。铝是地壳中含量最丰富的元素之一,人们在日常生活中通过空气、水、食物、食品添加剂等途径摄入铝,并在体内蓄积产生毒性效应。铝可以影响神经系统的多种功能,特别是学习与记忆功能。铝在老年性痴呆症(AD)、帕金森氏综合征(PD)、透析性脑病(DE)等神经退行性疾病中发挥的毒性作用已得到许多学者的肯定。牛磺酸(Taurine)又称α-氨基乙磺酸,是一种结构简单的含硫非蛋白氨基酸,普遍存在于生物体各组织器官中。作为调节正常生理活动的活性物质,牛磺酸在机体内发挥着广泛的生物学作用。本实验选用Wistar大鼠作为实验动物,六水氯化铝灌胃建立铝中毒模型后给予牛磺酸进行解毒,通过行为学实验、生物化学实验、病理形态学观察和测定铝元素及部分必需元素四个方面,研究和探讨牛磺酸对铝致大鼠学习记忆障碍的改善作用及相应机制。[方法]1.动物实验选择健康清洁级雄性Wistar大鼠54只,体重(180-220)g,分笼饲养,自由进食和饮水。适应环境一周后,按照体重随机将大鼠分为6组：阴性对照组、铝暴露组、牛磺酸低、中、高剂量组和牛磺酸预防组。所有大鼠均以灌胃方式给药,建立动物模型。阴性对照组每日给予生理盐水,剂量为1.0ml,其余各组给予剂量为281.40mg/(kg-d)的六水氯化铝,牛磺酸预防组每日在相同剂量染铝4小时后给予剂量为400mg/kg的牛磺酸,染毒时间为4周。铝中毒模型建立成功后,牛磺酸低、中、高剂量组大鼠分别给予剂量为200、400.800mg/(kg-d)的牛磺酸进行解毒,预防组每日给予牛磺酸剂量为400mg/kg,阴性对照组和铝暴露组用1.0ml/d生理盐水代替,解毒时间为4周。每组随机抽取2只大鼠,采用4%的多聚甲醛灌注固定,用来制作病理切片。剩余大鼠在Morris水迷宫实验结束后禁食24h,断头处死,迅速解剖分离出大脑,于-20℃保存备用。2.牛磺酸干预对铝染毒大鼠一般生长发育的影响每日观察实验大鼠的精神状况、进食及饮水情况,每周称重两次,记录体重变化并绘制相应曲线图。将大鼠处死后,迅速解剖出脑组织,称重,并计算脑系数。3.牛磺酸干预对铝染毒大鼠学习记忆功能的影响动物实验结束后,进行Morris水迷宫实验。实验分为两个阶段：1-4天训练期和第5天测试期。测定大鼠训练期内逃避平台时间、游泳总路程和测试期内目标象限游泳时间、穿越原逃避平台次数共4个指标,评估牛磺酸干预对染铝大鼠在学习、记忆功能方面的改善作用。4.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中必需元素的影响称取各组大鼠脑组织,用石墨消解仪消化。采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定脑组织中的铝元素,火焰原子吸收光谱法(AAS)测定钙、镁、铜、铁、锌元素。研究牛磺酸的排铝效果及对大鼠脑组织中必需元素的影响。5.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中一氧化氮合酶(NOS)及乙酰胆碱酯酶(AChE)活力的影响称取各组大鼠脑组织,制成匀浆,采用NOS测定试剂盒和T-ChE测定试剂盒分别测定大鼠脑组织中NOS及AChE的活力,研究牛磺酸对铝致乙酰胆碱类神经递质及一氧化氮功能损伤的恢复作用。6.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中单胺类神经递质含量的影响称取各组大鼠脑组织,采用高效液相色谱—荧光检测法检测大鼠脑组织中单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量,研究牛磺酸对铝致大鼠脑组织单胺类神经递质代谢紊乱的缓解作用。7.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的影响7.1方法学研究采用高效液相色谱—二极管阵列检测法检测大鼠脑组织中天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、牛磺酸(Tau)和Y-氨基丁酸(y-GABA)的含量。色谱柱：Agilent C18柱(150mmx5mm,4.6μm);流动相：A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液(HAC调pH=6.0),B为乙腈,C为水；流速：1.0ml/min;柱温：40℃；进样量：10μl；检测波长：350nm。梯度洗脱程序为：0-5min, A:B:C(V:V:V)=65:17.55:17.55;5-14min, A:B:C (V:V:V)=40:30:30。7.2大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的测定称取各组大鼠脑组织,采用上述研究方法对大鼠脑组织中5种氨基酸类神经递质的含量进行测定,研究牛磺酸对铝致大鼠脑组织中氨基酸类神经递质代谢紊乱的恢复作用。8.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织损伤的形态学观察采用4%多聚甲醛灌注固定大鼠脑组织,修块后制作石蜡切片,经苏木素—伊红(HE)染色后于显微镜下观察脑组织病理学形态,研究牛磺酸对染铝大鼠脑组织病理损伤的恢复作用。[结果]1.牛磺酸干预对铝染毒大鼠一般生长发育的影响铝暴露组大鼠发育迟缓且有萎靡现象,其他各组实验大鼠一般状况良好。自第6周起,铝暴露组的大鼠体重增长值开始明显低于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)；至第8周时,牛磺酸预防组的大鼠体重增长值已显著高于铝暴露组(P<0.05)。铝暴露组大鼠脑系数显著高于阴性对照组和牛磺酸预防组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.牛磺酸干预对铝染毒大鼠学习记忆功能的影响随训练时间增加,各组实验大鼠逃避时间和游泳总路程均呈下降趋势,铝暴露组较其他各组下降缓慢,相互比较无统计学差异(P>0.05)。测试期间,阴性对照组大鼠在目标象限的游泳时间明显长于铝暴露组,牛磺酸中、高剂量组及预防组大鼠在目标象限的游泳时间与铝暴露组相比,呈不同程度增长,差异均有统计学意义(P<0.01)；与阴性对照组比较,铝暴露组大鼠在目标平台的穿越次数明显减少,牛磺酸中、高剂量组及预防组大鼠在目标平台的穿越次数明显多于铝暴露组,有统计学差异(P<0.01)。3.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中必需元素的影响A1元素在铝暴露组大鼠脑组织中的含量显著高于阴性对照组、牛磺酸中剂量组和牛磺酸预防组,差异有统计学意义(P<0.05)。铝暴露组大鼠脑组织中Mg、Cu、Fe、Zn元素含量的降低较阴性对照组有统计学意义(P<0.05)。牛磺酸中、高剂量组及预防组大鼠脑组织中Mg、Zn元素的含量均显著高于铝暴露组,差异有统计学意义(P<0.05)；牛磺酸预防组大鼠脑组织中Cu元素的含量较铝暴露组显著增高,有统计学差异(P<0.05)；Fe元素在牛磺酸高剂量组大鼠脑组织中的含量高于铝暴露组,差异有统计学意义(P<0.05)。Ca元素在各组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。4.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中一氧化氮合酶(NOS)及乙酰胆碱酯酶(AChE)活力的影响铝暴露组大鼠脑组织中NOS活力值显著低于阴性对照组、牛磺酸中、高剂量组及预防组,差异有统计学意义(P<0.01)。AChE在铝暴露组大鼠脑组织中的活力值高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；牛磺酸中剂量组和预防组大鼠脑组织中AChE的活力值低于铝暴露组,有统计学差异(P<0.05)。5.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中单胺类神经递质含量的影响4种单胺类神经递质得到了较好分离,保留时间分别为1-NE(3.33min)、2-E (3.83min)、3-DA (5.52min)和4-5-HT (11.79min).分别以其浓度(C)对相应峰面积(A)进行线性回归,在0.02-0.4μg/ml范围内线性关系良好,相关系数均在0.999以上。铝暴露组大鼠脑组织中NE、E、DA、5-HT的含量显著低于阴性对照组,比较有统计学差异(P<0.05)。牛磺酸中剂量组NE、E、DA、5-HT的含量显著高于铝暴露组,差异有统计学意义(P<0.05)；牛磺酸预防组DA、5-HT的含量较铝暴露组显著增高,有统计学差异(P<0.05)。6.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的影响6.1方法学研究5种氨基酸类神经递质得到了较好分离,保留时间分别为1-Asp (5.66min)、2-Glu (7.39min)、3-Gly (11.14min)、4-Tau (11.85min)、5-y-GABA (13.55min)。分别以其浓度(C)对相应峰面积(A)进行线性回归,在10-200μg/ml范围内线性关系良好,相关系数均在0.999以上。Asp:A=13506.29C+84213.45, r=0.9991;检测限为3.05×10-3μg/ml；低、中、高三种浓度下的RSD日内为3.16%、2.13%、2.37%,RSD日间为4.78%、3.77%、5.05%,加标回收率为97.15%、89.17%、95.61%。Glu:A=12632.94C+62248.02, r=0.9994;检测限为2.03×10-3μg/ml；低、中、高三种浓度下的RSD日内为3.36%、2.32%、2.88%,RSD日间为5.21%、4.20%、3.95%,加标回收率为93.33%、95.01%、94.67%。Gly:A=26456.88C+69370.37, r=0.9992;检测限为9.84×10-4μg/ml；低、中、高三种浓度下的RSD日内为2.99%、3.35%、3.55%,RSD日间为5.48%、3.69%、4.17%,加标回收率为91.93%、97.18%、101.76%。Tau:A=16750.69C+67084.01, r=0.9993;检测限为1.04×10-3μg/ml；低、中、高三种浓度下的RSD日内为3.55%、1.98%、3.36%,RSD日间为4.51%、4.54%、4.40%,加标回收率为104.93%、96.02%、88.73%。y-GABA:A=19494.50C+67672.88, r=0.9993;检测限为6.50×10-4μg/ml；低、中、高三种浓度下的RSD日内为2.70%、2.56%、3.09%,RSD日间为3.80%、5.04%、4.03%,加标回收率为96.15%、93.15%、93.29%。6.2大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的测定铝暴露组大鼠脑组织中Asp和Glu的含量高于阴性对照组,Tau和γ-GABA的含量低于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Asp和Glu在牛磺酸中剂量组和预防组中的含量均显著低于铝暴露组,有统计学差异(P<0.05)；牛磺酸预防组中Tau和γ-GABA的含量较铝暴露组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)；Gly在各组之间比较均无统计学意义(P>0.05)。7.牛磺酸干预对铝染毒大鼠脑组织损伤的形态学观察与阴性对照组相比,铝暴露组大鼠海马组织中出现较多空泡,神经细胞线呈现模糊不清,细胞排列稀疏散乱,大脑皮层神经细胞出现核内空洞,核膜变形,核仁变小等现象；牛磺酸低剂量组无明显改善；牛磺酸中、高剂量及预防组均有明显改善,海马组织中神经细胞数目明显增多,细胞线较清晰,排列较整齐,皮层神经细胞胞浆较丰富,细胞核较清晰。[结论]1.牛磺酸能够改善铝致大鼠体重增长迟缓,对生长发育有促进作用。2.牛磺酸对染铝大鼠的学习记忆能力有明显改善作用。3.牛磺酸有一定的排铝效果,对铝致Mg、Cu、Fe、Zn元素的代谢紊乱有不同程度的改善和恢复作用,对Ca元素的代谢未产生显著影响。4.牛磺酸能够拮抗铝致NOS活力降低及AChE活力升高。5.牛磺酸能够缓解铝致单胺类、氨基酸类神经递质的代谢紊乱。6.形态学观察,牛磺酸对铝致大鼠脑组织病理损伤有恢复作用。综上所述,牛磺酸能够有效改善铝染毒所致的大鼠学习记忆功能障碍,对大鼠神经系统具有保护作用。