论文部分内容阅读
减数分裂是有性生殖的必要环节。在减数分裂过程中,细胞进行一次DNA复制和连续两次的染色体分离,最终产生了染色体数目减半的配子。同源重组是减数分裂的核心事件,其起始于Spo11介导的程序性DNA双链断裂（Double-strand break,DSB）,最终产生 了非交叉重组（Noncrossover,NCO）和交叉重组（Crossover,CO）。交叉重组在同源染色体之间建立了物理连接,保证了同源染色体的正确分离;同时也导致了同源染色体之间遗传物质的互换,促进了遗传的多样性。交叉干涉是交叉重组的重要特征。在减数分裂染色体上,一个位点产生的交叉会抑制其邻近区域交叉的产生,这种现象被称为交叉干涉。交叉干涉广泛存在于各个物种的减数分裂过程中,参与调控减数分裂染色体上交叉重组的数量和分布。但是,交叉干涉的本质、交叉干涉的产生过程,以及交叉干涉的调控通路仍知之甚少。研究表明,拓扑异构酶Ⅱ（Top2）能够调节减数分裂交叉干涉。Top2是各个物种中普遍存在的关键蛋白,能够移除基因组上的负超螺旋和DNA分子之间的连接等DNA结构。在酿酒酵母中,特异性敲除减数分裂中的TOP2、表达催化活性缺失的top2或移除Top2的类泛素化修饰（Small ubiquitin-like modifier,SUMO）都导致交叉干涉的强度减弱,进而导致交叉重组的数量增多。但是,Top2调节减数分裂交叉干涉的分子机制仍不清楚。本文以酿酒酵母为实验材料,深入探究了 Top2对交叉干涉和交叉重组的调节作用,及其具体的分子机制。主要的研究结果如下:（1）Top2的链式通道反应是酵母减数分裂所必需的。Top2通过链式通道反应（Strand passage reaction,SPR）发挥其生物学功能。本文探究了 Top2链式通道反应缺陷对减数分裂基本表型、交叉干涉和交叉重组的影响。结果显示,当top2突变导致其不能剪切DNA双链或能够剪切DNA双链,但是不能重新连接（或释放）DNA时,细胞出现了严重的核分裂、染色体轴形成、同源染色体联会、产孢和孢子存活缺陷。此外,当top2突变导致其不能剪切DNA双链时,细胞内的交叉干涉强度减弱,交叉重组数量增多;当top2突变导致其能够剪切DNA双链,但是不能重新连接或释放DNA时,细胞内的交叉干涉强度增强,交叉重组数量减少。因而,Top2链式通道反应的顺利进行是保证减数分裂完成、稳定交叉干涉强度和维持交叉重组数量所必需的。（2）Top2以剂量依赖的方式调节减数分裂交叉干涉,进而调节交叉重组。为探究Top2的表达量变化对交叉干涉和交叉重组的影响,本文检测了不同Top2表达量菌株的交叉干涉和交叉重组情况。结果显示,Top2的含量与交叉干涉的强度呈正相关;与交叉重组的数量呈负相关。这些结果表明,Top2以剂量依赖的方式调节交叉干涉的强度,进而调节交叉重组的数量。（3）Top2类泛素化修饰通过调节的Top2含量来调节交叉干涉和交叉重组。为探究Top2类泛素化修饰是如何调节交叉干涉和交叉重组的,本文检测了不同Top2类泛素化修饰缺失突变体的交叉干涉和交叉重组情况。结果显示,当Top2的类泛素化修饰缺失时,染色质上Top2的含量降低,交叉干涉减弱,交叉重组数量增多。该结果表明Top2的类泛素化修饰通过调节染色质上Top2的含量来调节减数分裂交叉干涉的强度,进而调节交叉重组的数量。（4）Top2通过调节负超螺旋的含量来调节交叉干涉的强度。为了解析Top2调节交叉干涉的分子机制,本文首先在酵母中表达了分别具有移除负超螺旋活性或移除DNA分子之间连接活性的拓扑异构酶,探究了 Top2调节交叉干涉依赖的是其中的哪一种活性。结果显示,当异源表达具有移除负超螺旋活性的拓扑异构酶使细胞内的负超螺旋含量降低时,交叉干涉的强度增强,交叉重组的数量减少;当异源表达具有增加负超螺旋活性的拓扑异构酶使细胞内的负超螺旋含量升高时,交叉干涉的强度减弱,交叉重组的数量增加;而当异源表达只具有移除DNA分子之间连接活性的拓扑异构酶,不改变细胞内的负超螺旋含量时,交叉干涉的强度和交叉重组的数量未发生明显改变。因而,Top2调节交叉干涉的强度和交叉的重组数量依赖的是其移除负超螺旋的活性。同时,本文也通过染色质免疫沉淀（Chromatinimmunoprecipitation,ChIP）测序和免疫荧光技术探究了负超螺旋在基因组上的分布及其与交叉重组的关系。结果显示,负超螺旋定位于减数分裂重组位点,并且负超螺旋的含量与交叉干涉的强度呈负相关,与交叉重组的数量呈正相关。在负超螺旋含量越高的菌株中,交叉干涉的强度越弱,交叉重组的数量越多;而在负超螺旋含量越低的菌株中,交叉干涉的强度越强,交叉重组的数量越多。综合以上结果可以得出,Top2通过调节细胞内负超螺旋的含量来调节减数分裂节交叉干涉的强度,进而调节交叉重组的数量。综上所述,Top2是一个关键的交叉干涉和交叉重组调节因子。Top2 SPR、Top2表达量和Top2类泛素化修饰都能够调节减数分裂交叉干涉的强度,进而调节交叉重组的数量。同时,Top2调节交叉干涉和交叉重组依赖其移除负超螺旋的活性。此外,本文也证明负超螺旋定位于减数分裂重组位点,并且负超螺旋的含量与交叉干涉的强度和交叉重组的数量具有相关性。据此,本文提出Top2通过调节减数分裂细胞内负超螺旋的含量来调节交叉干涉的强度,进而调节交叉重组的数量。