中国作为肝癌的重灾区，肝癌研究的任务艰巨，尽管近年来手术、放化疗等多种治疗手段在不断进步，但肝癌患者的5年生存率仍然很低。随着人们对肿瘤研究的深入推进，大量研究指向肿瘤干细胞的存在是肿瘤复发、转移的关键，找到并研究肿瘤干细胞赖以维持的条件，进而开发针对性的治疗手段成为肿瘤学研究的一个重要方向，肝癌干细胞研究也因此被寄予厚望。与黑色素瘤、乳腺癌等具有较为明确的肿瘤干细胞标记物不同，在本课题开展之前，多个研究小组已陆续建立了以CD133、EpCAM、CD90、CD13和CD24等为标记物的肝癌干细胞模型，并且在课题开展过程中新的标记物仍在不断涌现。之所以有如此多的肝癌干细胞模型出现，其中的一个重要原因是这些标记物在各研究小组之间研究结果的不一致甚至是难以重复。提示这些标记物对于特定研究条件的依赖，也一定程度上反应了这些标记物自身的不稳定性。而这种肝癌干细胞研究看似表面上的百花齐放，在实质上已经阻碍了对其更深层次机制研究的继续推行。然而，纵然有这些肝癌干细胞标记物和肝癌干细胞模型的存在，但实质不变的是，这些肝癌干细胞的维持都依赖于细胞内的干性调控网络。因此本研究从肿瘤干细胞与胚胎干细胞的相似性入手，以胚胎干细胞自我更新维持的核心分子Nanog为标记，建立了一套全新的肝癌干细胞分选模型，并围绕其生物学特性、自我更新机制以及与其他肝癌干细胞标记物之间的相互关系展开研究。在此基础上，我们进一步对课题研究过程中发现的肝癌干细胞标记物自身及相互间转化的新现象及其发生机制进行了探讨。本文的主要研究方法、研究结果如下：1.证明了Nanog可以作为肝癌干细胞的新标记物分子（1）证明Nanog可以作为肝癌预后的标记物。Western Blot证明Nanog在肝癌组织中相对癌旁组织高表达；IHC检测了Nanog在59例肝癌组织的表达水平，分析显示Nanog表达水平与肝癌临床复发以及包膜和血管浸润显著相关，Kaplan-Meier生存曲线分析显示Nanog与患者总生存期和无病生存期显著相关。（2）构建了由Nanog启动子驱动的荧光报告系统。完成Nanog启动子驱动的GFP报告慢病毒系统的构建，经验证被病毒感染的细胞中，GFP的表达强度可以反映内源Nanog的表达水平。（3）证明Nanog阳性细胞具有更强的自我更新能力。实验结果显示Nanog阳性细胞具有更强的细胞球形成、克隆形成、体内成瘤以及多向分化能力。（4）证明Nanog阳性细胞具有高侵袭、强耐药以及慢增殖的特性。Transwell实验证明Nanog阳性细胞具有更强的侵袭和迁移能力，蛋白水平检测证明Nanog阳性细胞表现出EMT特征，体内转移实验证明Nanog阳性细胞具有更强的转移能力；细胞杀伤实验证明Nanog阳性细胞对肝癌化疗药物Sorafenib以及顺铂具有更强的抵抗特性，RNA水平检测证明Nanog阳性细胞高表达多个耐药基因；免疫荧光染色证明Nanog强阳性细胞中Ki67标记阳性率较低，单细胞增殖实验表明Nanog强阳性细胞增殖较慢。2.明确了Nanog阳性肝癌干细胞的自我更新机制（1）证明Nanog是维持肝癌干细胞自我更新的必要分子。慢病毒RNA干扰试验显示干扰Nanog的表达可显著降低细胞的细胞球形成能力、克隆形成能力以及迁移能力，并导致细胞中干细胞相关基因Oct4和Sox2表达下调而成熟肝细胞标记物AFP、CK8、CK18、TTR表达上调。成瘤实验表明在Nanog阴性细胞中过表达Nanog，可明显提升其成瘤能力，Transwell实验显示过表达后细胞的迁移能力显著增强。（2）发现IGF信号通路在Nanog阳性细胞中激活。全基因表达谱分析显示IGF信号通路多个分子在Nanog阳性细胞中高表达，进一步qRT-PCR验证表明IGF2及其受体IGF1R在阳性细胞中显著上调。（3）证明Nanog可以调控IGF1R的表达水平。Western Blot实验证明在Nanog阳性细胞中干扰Nanog可以导致IGF1R下调，反之在Nanog阴性细胞中过表达Nanog则引起IGF1R表达上调。ChIP实验证明Nanog可以结合到IGF1R启动子，提示Nanog可能通过激活IGF1R转录从而上调其表达。（4）证明IGF信号可调控细胞的自我更新能力以及Nanog的表达。实验结果显示IGF1R抑制剂PPP和AEW541处理可以显著降低细胞的细胞球形成能力，并同时显著下调Nanog的RNA水平。3.明晰了肝癌干细胞6种标记物在肝癌中的分布概况及相关性（1）明确了肝癌细胞中6种肝癌干细胞标记物的表达概况。通过流式细胞术对3种肝癌细胞系和5种肝癌原代细胞中的CD133、EpCAM、CD90、CD24、CD13以及Nanog总计6种肝癌干细胞标记物的表达进行检测，发现CD13和CD24在多数细胞中呈高表达、CD133和EpCAM表达在细胞中异质性较大、Nanog表达稳定在10%左右、而除SMCC-7721细胞以外CD90在所检细胞中几乎不表达。（2）发现肝癌细胞可区分为高自我更新能力和低自我更新能力两类。通过克隆形成、细胞球形成以及体内成瘤能力检测，发现三种能力在所检的8种肝癌细胞中存在显著差异，并且可以由此将细胞明显区分为高低自我更新能力两类。（3）发现CD133和EpCAM的表达水平可以区分高低自我更新能力的两类细胞。通过对高低自我更新能力的两类肝癌细胞中6种标记物的表达情况进行统计分析，发现CD133和EpCAM在高自我更新的肝癌细胞中比例显著高于在低自我更新细胞中的相应比例。（4）建立和应用了6种肝癌干细胞共标记的方法。通过使用标记不同荧光的干细胞标记物，共同标记细胞，通过调整荧光补偿可以将几类标记明显区分，继而利用该方法完成了8种肝癌细胞6种不同荧光共标记的检测。（5）分析发现肝癌细胞中肝癌干细胞标记物的表达存在有限的特征组合，建立了肝癌中6种干细胞标记物的分布概况图。基于上述6种荧光共标记检测结果，分析显示所检的8种肝癌细胞的细胞主体均分布在有限的标记组合中，进一步通过对6种标记物两两间的重叠与包含情况的分析，我们描绘了肝癌中6种干细胞标记物的分布概况图。4.建立了基于Nanog和CD133为标记的肝癌干细胞层级分化模型（1）分析发现CD133是高丰度干细胞标记物中对肝癌细胞自我更新能力区分最好的标记。通过对不同自我更新能力的肝癌细胞中6种肝癌干细胞共标记数据进行分析，确定CD133是高丰度标记物中对高低自我更新能力的细胞区分度最好的标记分子。（2）发现Nanog相比CD133，对自我更新能力的指示作用更“显性”。克隆形成和成球能力检测显示，两个标记中当Nanog标记为阳性时，无论细胞的CD133表达阳性或者阴性，均表现出更强的自我更新能力。（3）建立了基于CD133和Nanog双标记的肝癌干细胞层级分化模型。通过细胞群体和单细胞分化两种方法检测双标记细胞中细胞的分化方向，结果显示Nanog标记的细胞存在由强到弱、由阳到阴的单向性分化，而CD133标记的阴阳以及强弱细胞间可以相互转化。进一步结合细胞的成球能力检测，确定该模型中细胞的分化方向为NanogHighCD133Low/Neg到NanogHighCD133High到NanogLowCD133Pos/Neg再到NanogNegCD133Pos最终到NanogNegCD133Neg。5.阐明了肝癌干细胞6种标记物自身及相互间的转化情况（1）证明肝癌细胞干细胞标记物存在自发转变。利用流式细胞仪将6种肝癌干细胞标记物的阴阳细胞分开，并分别进行群体和单细胞克隆培养。复检结果显示在6种肝癌干细胞标记物中CD133、CD13和CD24三种标记物阴性和阳性细胞间转变较为明显。其他标记中，CD90阴性细胞转变为CD90阳性细胞的概率较低；EpCAM阳性细胞则表现出两种状态，在Huh7细胞中EpCAM阳性和阴性细胞间几乎不转化，而在T1224中则倾向于向EpCAM阳性状态转化；Nanog则表现为阳性到阴性的单向转化。（2）证明肝癌干细胞标记的转变不依赖于细胞分裂。使用4mM的丁酸钠处理将细胞阻断在G0/G1期后，肝癌干细胞表面标记物阴性与阳性细胞间的转化仍会发生。（3）发现肝癌干细胞表面标记物间存在相互转变。对肝癌干细胞的6种标记物进行两两双标记进而体外培养并复测这些标记物的表达改变，发现Nanog以外的5种表面标记物中除CD90，其他表面标记分子均存在相互间自发转变；与此不同，我们发现Nanog阳性细胞具有向其他标记分子阳性细胞的单向转变能力，即Nanog阳性细胞可以产生其余5种标记的阳性细胞，反之这些标记物阳性但Nanog阴性的细胞在常规条件下均无法转变产生Nanog阳性细胞。（5）绘制了肝癌干细胞标记物自身及相互间的转化关系图。通过总结上述Huh7细胞中各种标记物的自身及相互间转化的数据，得到了这些标记物的转化关系图。6.初步探明了Nanog阴性细胞在体内特定条件下逆转的条件及其分子机制（1）发现Nanog阴性细胞可以在体内转变为Nanog阳性细胞。在Nanog阴性细胞体内所成肿瘤中可检出有GFP荧光出现，将其中的GFP阳性和阴性细胞分离出来后进行成瘤、克隆形成和成球实验均表明逆转得到的是有功能的Nanog阳性细胞。（2）证明Matrigel可以诱导Nanog阴性细胞逆转。在体外条件下，Nanog阴性细胞用Matrigel培养，可以产生Nanog阳性细胞，并且证明逆转得到的阳性细胞比阴性细胞具有更强的成球能力。（3）证明Nanog阴性细胞逆转是其体内成瘤的重要先决条件。构建了Nanog携带自杀基因TK的慢病毒载体Lv-NTPF以及对照载体Lv-NGPF，Western Blot和流式检测证明该系统可以有效清除Nanog阳性细胞；使用上述系统清除Nanog阳性细胞后，细胞的克隆形成、成球以及成瘤能力均显著降低；小鼠体内实验进一步证明，在加入TK底物GCV的情况下，携带Lv-NTPF的细胞难以起始肿瘤，撤除GCV药物后肿瘤生长得到恢复。（4）发现Matrigel中的Laminin成分是诱导Nanog阴性细胞逆转的重要因素。体内成瘤实验发现生长因子减少的Matrigel与常规Matrigel具有相同的促成瘤作用，提示诱导逆转的因素应在两者共同的基质成分中；体外分别使用Matrigel的两种主要基质成分Collagen I和Laminin-1作为支撑成分，进行Nanog阴性细胞的逆分化研究，发现其中Laminin-1可以在体外连续培养的条件下诱发阴性细胞逆转。（5）发现Erk/STAT3信号通路可能参与Nanog阴性细胞的逆转。Western Blot检测显示Erk在Nanog阴性细胞中的磷酸化水平高于阳性细胞，且阳性细胞分化后Erk磷酸化水平也上升，而STAT3则表现恰恰相反；Western Blot进一步也证明Matrigel和Laminin可诱导Nanog阴性细胞中的Erk和STAT3的磷酸化状态向Nanog阳性细胞相同的方向转变。综上所述，本研究的主要结论是：1. Nanog可以作为肝癌干细胞的新标记物，其可与IGF信号形成正反馈调节通路，调控肝癌干细胞的自我更新。2. Nanog和CD133能很好的指示和区分肝癌细胞的自我更新能力，在以二者为基础建立的肝癌干细胞分化模型中，Nanog处在分化层级的较顶端。3. Nanog阴性细胞在体内可以逆转为阳性细胞，在体外可以通过添加Matrigel模拟这种转变，而Matrigel的基质成分Laminin在逆转中扮演着重要的角色，逆转的机制可能是通过Erk/STAT3信号通路实现。综上所述，本研究对现有肝癌干细胞标记物进行了初步地梳理，因此可在一定程度上加深人们对肝癌干细胞的理解和认识，具有一定的理论意义。而对Nanog阳性肝癌干细胞的自我更新机制以及体内逆分化机制的探讨，也为针对性开发肿瘤治疗药物提供很好的提示意义，具有一定的临床应用前景。