肺癌仍然是全球常见的第二位肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占70%。在过去的20年中针对NSCLC尤其是肺腺癌中多种驱动癌基因的分子畸变及靶向药物、免疫治疗的研究得到了广泛及深入的研究。依据基因突变情况采用相对应的靶向药物治疗,给肺癌患者带来了新的治疗手段和一定的疗效,但仍有大量未知的癌基因未被发现或作用不明。至今肺癌依旧是一种异质的、复杂的、具有挑战性的难治性恶性疾病,其发病率和死亡率仍然居高不下,总体治疗效果不尽如人意。深入研究非小细胞肺癌致病原因、发生、发展和转移的分子生物学机制,探索早期诊断、监测和治疗肺癌的相关标记物和基因及免疫治疗靶点,依旧是研究重点、热点和研究的方向。ARHGAP10与Ras基因同源,同属于G蛋白超家族的其中一员,在多种人体正常组织及恶性肿瘤实验细胞系中表达阳性。ARHGAP10的过表达或缺失对多种恶性肿瘤的侵袭性和迁移具有调控作用。但由于ARHGAP10结构的复杂性和其在不同的肿瘤细胞中表达区域和调控方式有其独特性,目前人们对ARHGAP10在肺NSCLC中的表达及作用机制还未有研究报道。深入研究ARHGAP10在NSCLC中的表达与调控功能对于阐明ARHGAP10与NSCLC之间的调控机制具有重要的临床意义,通过进一步深入的研究将有望为ARHGAP10相关非小细胞肺癌的临床治疗提供靶点,促进相关药物的研发。第一部分:ARHGAP10在非小细胞肺癌中的表达的临床研究目的研究良性肺肿瘤组织和早、中、晚期三个不同阶段的NSCLC组织中ARHGAP10的免疫组化表达情况。分析不同阶段的肺癌组织中ARHGAP10的表达情况,及其与常用免疫组化指标、循环血肿瘤细胞及EGFR基因突变之间的相关性,以期为ARHGAP10在NSCLC中的进一步研究提供初步的研究方向和理论支持。方法选取120例样本,良性肺肿瘤组织和早、中、晚期三个不同阶段的NSCLC组织各30例,采用免疫组化方法检测ki67、P53、EGFR、VEGF、ARHGAP10四组中表达情况,免疫磁珠富集及探针荧光原位杂交检测外周血循环血肿瘤细胞(CTC)计数情况,蝎形探针扩增阻滞突变系统(ARMS)及直接测序法检测EGFR突变情况,并对实验结果根据样本的临床病理特征进行分类汇总。结果:1)ARHGAP10表达在良性肺肿瘤组织与NSCLC间有明显差异;随着肿瘤分期的严重程度ARHGAP10蛋白表达强度值逐渐降低,极个别甚至表达缺失。2)ki67、P53、EGFR、VEGF与ARHGAP10五项指标免疫组化的阳性表达彼此独立3)VEGF与ARHGAP10在四组中强阳性表达情况线条图有明显反向趋势。4)CTCS四组间阳性检出率比较有统计学差异(P<0.01)。有淋巴结转移的NSCLC组(92.3%)高于无淋巴结转移的NSCLC组(61.1%),两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。ARHGAP10阳性表达与CTCs>l之间两组比较无明显的相关性(P<0.01)。5)ARHGAP10阳性表达与NSCLC的临床病理特征无明显相关性。EGFR免疫组化阳性表达与EGFR基因突变之间无明显的相关性。ARHGAP10阳性表达与EGFR基因突变及其突变类型类型均无明显的相关性。结论本实验提示ARHGAP10的表达与NSCLC发生、发展存在某种联系但与NSCLC的临床病理特征无明显相关性;VEGF强阳性表达与ARHGAP10强阳性表达在不同NSCLC临床分期中可能存在一定的相关性,并且负相关的可能性较大,在后续的实验中值得进一步研究两者的关联。CTCS检测阳性对于NSCLC患者组有无淋巴结转移有一定的参考价值。免疫组化的EGFR阳性结果并不能预测NSCLC一定存在EGFR基因突变,ARHGAP10的表达与EGFR基因突变之间无明显的相关性。提示ARHGAP10可能与EGFR酪氨酸激酶途径信号通路关联性不高,在该信号通路是否有进一步的深入研究的价值需要仔细斟酌。第二部分:ARHGAP10在非小细胞肺癌中的表达的基础研究目的基于第一部分ARHGAP10与肺癌的不同阶段的研究,本研究拟通过体内外实验验证ARHGAP10与人肺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭的相关性。方法首先通过对选用的4种肺癌细胞系(A549、NCI-1975、NCI-H1299和NCI-H460)中ARHGAP10的蛋白水平和mRNA 水平进行检测。并在ARHGAP10低表达的细胞中转染ARHGAP10慢病毒表达质粒,随即通过WB和RT-PCR检测技术验证转染效果。同时观察ARHGAP10低表达的细胞中转染ARHGAP10慢病毒表达质粒后,取不同时间点检测该细胞系的增殖速率、迁移和侵袭能力的变化。为进一步探讨ARHGAP10在影响细胞生理功能改变的机制,本研究利用生物信息学GSEA对其影响通路进行预测,并对信号通路中一些重要的关键因子进行验证。此外本研究还通过裸鼠荷瘤模型——转染前后的A549细胞经尾静脉注射后,观察肺组织癌灶情况。结果体外培养的4种人肺癌细胞(A549,NCI-1975,NCI-H1299,NCI-H460)中ARHGAP10的蛋白质和mRNA的表达水平,数据显示NCI-1975和NCI-H1299两组细胞ARHGAP10表达水平相对较高,NCI-H460和A549两组细胞ARHGAP10表达水平相对较低。通过构建表达ARHGAP10的慢病毒质粒转染慢病毒,进而感染低表达的两组肺癌细胞A549和NCI-H460。ARHGAP10低表达的慢病毒感染肺癌细胞组其ARHGAP10蛋白质和mRNA的表达水平显著增强。野生型细胞和转入慢病毒载体的两者增值速度在24h、48h和72 h皆高于ARHGAP10慢病毒转染组细胞(A549和NCI-H460细胞),差异均具有统计学意义;同时研究发现,感染过表达ARHGAP10慢病毒的A549和NCI-H460细胞组细胞数量减低,且侵袭抑制作用受到明显抑制,差异均具有统计学意义。应用GSEA方法检测结果提示远处转移信号通路和Wnt信号通路中关键因子的表达与ARHGAP10的表达呈负相关。分别检测ARHGAP10高表达的对远处转移信号通路关键因子(MMP-2 MMP-9和VEGF)和Wnt信号通路关键因子(β-catenin,c-myc 和 p21)。ARHGAP10 过表达 A549 细胞组的 MMP-9,MMP-2,β-catenin和c-myc蛋白表达水平皆显著降低,p21表达增加,差异均具有统计学意义。ARHGAP10 过表达 NCI-H460 细胞组的 MMP-9,MMP-2,β-catenin 和 c-myc 蛋白表达水平皆显著降低,p21表达增加,差异各自具有统计学意义。用10mM氯化锂刺激过表达ARHGAP10的A549细胞组β-catenin在氯化锂刺激后表达上调,差异均具有统计学意义。尾静脉注射转染Vector的A549+肺癌细胞裸鼠组分离出肺组织后,肉眼可见肺部肿瘤结节形成,HE染色后显微镜下观,肿瘤细胞核大深染,呈现圆形,核仁明显,可见分裂象,胞浆丰富;尾静脉注射转染ARHGAP10过表达病毒的A549+肺癌细胞裸鼠组分离出肺组织后肉眼观未见明显异常,镜下观未见明显异常。结论本实验通过GSEA确定ARHGAP10可能在肺癌中调节的确切途径。应用富集分析发现远处转移(metastasis)通路和Wnt信号通路与ARHGAP10表达呈负相关。本实验通过生物技术转染病毒质粒,验证了高表达ARHGAP10对远处转移信号通路关键因子(基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2),基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)MMP-9 和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF))和 Wnt 信号通路关键因子(β-catenin,c-myc 和 p21)的影响。证实ARHGAP10的过表达可显著抑制多株人肺癌肿瘤细胞的增殖,并抑制细胞侵袭和迁移,在恶性肿瘤的进展中具有重要意义。综上所述,ARHGAP10或可作为肺癌诊断的一个有效的生物标志物,或可作为临床肺癌的治疗靶标。