【摘 要】
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本论文利用毕赤酵母高拷贝质粒和大肠-枯草芽孢杆菌穿梭质粒,将外源基因蚓激酶F238分别克隆至毕赤酵母和枯草芽孢杆菌中进行表达,并对工程菌的培养条件进行了优化。主要研究结果如下：应用PCR技术扩增获得蚓激酶F238成熟肽基因,分别将其克隆至毕赤酵母和枯草芽孢杆菌表达载体pPIC3.5K和pPBE2R中,构建了两个表达载体：pPIC3.5K-F238、pPBE2R-F238。毕赤酵母GS115表达蚓激
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本论文利用毕赤酵母高拷贝质粒和大肠-枯草芽孢杆菌穿梭质粒,将外源基因蚓激酶F238分别克隆至毕赤酵母和枯草芽孢杆菌中进行表达,并对工程菌的培养条件进行了优化。主要研究结果如下：应用PCR技术扩增获得蚓激酶F238成熟肽基因,分别将其克隆至毕赤酵母和枯草芽孢杆菌表达载体pPIC3.5K和pPBE2R中,构建了两个表达载体：pPIC3.5K-F238、pPBE2R-F238。毕赤酵母GS115表达蚓激酶的研究。将重组质粒pPIC3.5K-F238线性化后用电穿孔方法转入Pichia pastoris GS115中,首先筛选出his+MutS表型转化子,再用不同浓度的G418抗生素选择耐高抗性菌株。本研究获得1株耐3mg/mLG418的阳性重组菌株,经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE电泳检测异源表达产物相对分子量为2.8×104Da,与预期值相符,采用纤维蛋白平板法检测目的蛋白酶活为257.6U/mL。枯草芽孢杆菌WB600表达蚓激酶的研究。重组质粒pPBE2R-F238采用化学转化方法导入Bacillus subtilis WB600中,SDS-PAGE电泳检验发酵液中外源表达产物相对分子量为2.8×104Da,与蚓激酶分子量大小一致；纤维蛋白原平板检测结果证明具有纤溶活性213.7U/mL。对工程菌的发酵培养基和发酵条件进行优化,结果为：接种种龄18h的菌液至含40mL培养基的250mL三角瓶中,pH7.0、37℃下培养22h,最终酶活达到593.5U/mL。培养基以20g/L玉米粉、10g/L豆饼粉、0.4g/L氯化钾、0.1g/L硫酸镁、0.3g/L氯化钙、0.05g/L氯化铁组成。
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