【摘 要】
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目的:本研究使用小鼠下丘脑视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus,SCN）星型胶质细胞（Astrocyts,ASTs）制备视神经炎脊髓炎（Optic neuritis myelitis,NMO）细胞模型,试图探讨视神经脊髓炎谱系疾病（NMO spectrum disorder,NMOSD）免疫损伤和昼夜节律紊乱之间的关系,探索ASTs调控NMOSD昼夜节律的细胞分子机制,为NM
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目的:本研究使用小鼠下丘脑视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus,SCN）星型胶质细胞（Astrocyts,ASTs）制备视神经炎脊髓炎（Optic neuritis myelitis,NMO）细胞模型,试图探讨视神经脊髓炎谱系疾病（NMO spectrum disorder,NMOSD）免疫损伤和昼夜节律紊乱之间的关系,探索ASTs调控NMOSD昼夜节律的细胞分子机制,为NMOSD及其他昼夜节律紊乱提供可能干预的靶点和药物。方法:1.原代ASTs的NMO模型在鼠SCN的ASTs原代培养中加入人水通道蛋白4（Aquaporin-4,AQP4）抗体（5 ug/m L）及补体（10 ug/m L）制备NMO体外细胞培养模型,利用饥饿法进行调定生物钟时间,在特定时间点检测Cx43蛋白、谷氨酸、时钟基因Clock/Bmal1表达节律。将ASTs与原代神经元进行共培养,检测神经元VIP释放节律。2.Cx43抑制或诱导在鼠SCN正常和NMO ASTs模型中加入Cx43半通道阻滞剂-TAT-Gap19（20 u M）或Cx43诱导剂-亚油酸（Linoleic acid,LA,,50 u M）。3.谷氨酸受体抑制或添加在鼠SCN正常和NMO ASTs模型中加入谷氨酸NMDA受体（N-methyl-d-aspartate receptor,NMDAR）非竞争性拮抗剂-DQP-1105（20 u M）或谷氨酸（Glutamate,Glu,50 u M）。4.时钟基因Bmal1基因沉默将ASTs原代培养中,时钟基因Bmal1沉默后,检测各时间点免疫因子的变化情况。结果:1.AQP4抗体导致SCN ASTs的Cx43、谷氨酸、Clock/Bmal1基因m RNA表达/释放节律紊乱:与对照组相比,NMO组中SCN ASTs中Cx43（CT12 P＜0.01;CT18,CT24 P＜0.001）、谷氨酸（CT12,CT18 P＜0.05;CT24 P＜0.01）、Clock基因m RNA（CT12,CT18 P＜0.05;CT24 P＜0.001）、Bmal1基因m RNA（CT12 P＜0.05;CT18 P＜0.01;CT24 P＜0.001）在主观夜（CT12-CT24）表达/释放减少。2.ASTs中Cx43调节谷氨酸释放节律:与对照组相比,NMO组中SCN ASTs的谷氨酸释放减少（P＜0.001）。在对照组,加入Cx43蛋白阻滞剂（TAT-Gap19）使谷氨酸水平减少（P＜0.0001）;在NMO组,加入Cx43诱导剂（Linoleic acid）使谷氨酸水平增加（P＜0.0001）。3.ASTs中谷氨酸影响神经元VIP释放节律:与对照组相比,NMO组中神经元VIP释放较少（P＜0.001）。在对照组,加入谷氨酸受体拮抗剂（DQP-1105）使神经元VIP水平减少（P＜0.05）;在NMO组,增加谷氨酸使神经元VIP水平增加（P＜0.0001）。4.ASTs中Cx43与时钟基因存在双向调节关系:（1）ASTs中Cx43影响时钟基因m RNA表达节律:与对照组相比,NMO组中Clock/Bmal1基因m RNA表达下降（P＜0.0001）。在对照组,加入Cx43蛋白阻滞剂（TAT-Gap19）使Clock基因m RNA的表达减少（P＜0.001）。在对照组,加入Cx43蛋白阻滞剂（TAT-Gap19）使基因m RNA的表达减少（P＜0.0001）;在NMO组,加入Cx43诱导剂（Linoleic acid）使Bmal1基因m RNA的表达增加（NMO+Linoleic acid组P＜0.05;Blank组P＜0.0001）（2）ASTs Bmal1基因影响Cx43表达节律:在小鼠ASTs Bmal1基因沉默实验中,实验组（Ad-sh-Bmal1）较阴性对照组（Ad-sh-NC组）Cx43表达减少（DQP-1105组P＜0.01;Blank;TAT-Gap19;NMO+Linoleic acid;NMO+Glu组P＜0.0001）。结论:1.AQP4抗体导致ASTs中Cx43、谷氨酸、Clock/Bmal1基因m RNA表达/释放节律紊乱。2.ASTs中Cx43调节谷氨酸释放节律。3.ASTs中谷氨酸影响神经元VIP释放节律。4.昼夜节律与炎症存在双向调节关系。
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