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目的:本研究通过动物实验探讨氟、砷单独及联合染毒对大鼠学习记忆能力、大脑组织细胞形态结构及脑内神经递质和酶的影响特点及规律;通过体外细胞实验探讨氟、砷单独及联合染毒对大鼠海马神经元细胞氧化应激损伤、DNA损伤及细胞凋亡的影响规律及其相互关系;探讨Ras/ERK信号通路在氟、砷致学习记忆损伤中的作用及其影响机制,为氟、砷单独及其联合中毒的防治提新的思路及科学理论依据。方法:本研究采用2因素3水平的析因设计,将108只初断乳清洁级SD大鼠按体重随机分为9组,分别为对照(蒸馏水)组、低剂量亚砷酸钠(1/50 LD50,0.75 mg/kg·d)染毒组、高剂量亚砷酸钠(1/25 LD50,1.5 mg/kg·d)染毒组、低剂量氟化钠(1/20 LD50,25 mg/kg·d)染毒组、高剂量氟化钠(1/10 LD50,50 mg/kg·d)染毒组、低剂量亚砷酸钠(0.75 mg/kg·d)+低剂量氟化钠(25 mg/kg·d)联合染毒组、低剂量亚砷酸钠(0.75 mg/kg·d)+高剂量氟化钠(50 mg/kg·d)联合染毒组、高剂量亚砷酸钠(1.5 mg/kg·d)+低剂量氟化钠(25 mg/kg·d)联合染毒组以及高剂量亚砷酸钠(1.5 mg/kg·d)+高剂量氟化钠(50 mg/kg·d)联合染毒组,每组12只,雌雄各半。自由饮水方式进行染毒,连续染毒6个月。采用Morris水迷宫及跳台实验评价大鼠学习记忆能力;利用透射电子显微镜观察大鼠大脑皮质神经元超微结构改变;采用酶联免疫吸附试验检测大鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶(Ach E)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)含量;采用化学比色法测定乙酰胆碱(Ach)含量、单胺氧化酶(MAO)、琥珀酸脱氢酶(SDH)及乳酸脱氢酶(LDH)活力。按照2因素3水平的析因设计,将体外培养的海马神经细胞分为9组,分别为对照(细胞培养液)组、低剂量亚砷酸钠(2μmol/L)染毒组、高剂量亚砷酸钠(10μmol/L)染毒组、低剂量氟化钠(10μmol/L)染毒组、高剂量氟化钠(50μmol/L)染毒组、低剂量亚砷酸钠(2μmol/L)+低剂量氟化钠(10μmol/L)联合染毒组、低剂量亚砷酸钠(2μmol/L)+高剂量氟化钠(50μmol/L)联合染毒组、高剂量亚砷酸钠(10μmol/l)+低剂量氟化钠(10μmol/l)联合染毒组以及高剂量亚砷酸钠(10μmol/l)+高剂量氟化钠(50μmol/l)联合染毒组。采用mtt还原法检测细胞存活情况;采用微量酶标法测定细胞中谷胱苷肽(gsh)含量;采用硫代巴比妥法(tba)测定谷胱苷肽过氧化物酶(gsh-px)含量;采用wst-i法测定超氧化物歧化酶(sod)活力;采用化学比色法测定丙二醛(mda)含量、总抗氧化能力(t-aoc)及过氧化氢酶(cat)活力;采用单细胞凝胶电泳法检测细胞dna损伤情况;采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡率;采用荧光分光光度法检测细胞中ca2+含量;采用westernblot法检测bax、bcl-2、ras、raf-1、pmek、perk1/2、pcreb及bdnf蛋白的表达;采用realtime-pcr检测ras、raf-1、mek、erk1、erk2、creb、bdnf、c-fos、c-jun、dnmt1、dnmt3a及dnmt3bmrna的表达。结果:1)水迷宫实验结果显示,高剂量砷、高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟以及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组与对照组相比,大鼠逃避潜伏期及首次抵达平台时间均明显延长(p<0.05),大鼠穿越平台次数均明显减少(p<0.05);跳台实验结果显示,高剂量砷及高剂量砷+高剂量氟联合组与对照组相比,潜伏期明显缩短(p<0.05),而第一次与第二次错误次数明显增多(p<0.05);透射电镜下可见高剂量砷、高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟、高剂量砷+高剂量氟联合染毒组大脑皮质神经细胞出现皱缩,细胞核明显变形,核内染色质分布不均匀,胞浆内部分线粒体肿胀,内质网扩张等结构改变。脑组织中神经递质检测结果显示,与对照组相比,高剂量砷、高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟以及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组大鼠脑组织中da含量明显下降(p<0.05);未发现氟砷联合对大鼠学习记忆能力、脑组织中神经递质及酶的影响呈现交互作用(p>0.05)。2)体外细胞实验结果显示,与对照组比较,高剂量砷、高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟以及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组海马神经细胞mtt吸光度值明显降低(p<0.05);高剂量砷及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组cat活力明显降低(p<0.05);高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组gsh含量明显降低(p<0.05);高剂量砷、高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组sod活力明显降低(p<0.05);高剂量砷、高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组gsh-px含量明显降低(p<0.05);高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟以及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组t-aoc明显降低(p<0.05);高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟以及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组mda含量明显升高(p<0.05);彗星实验结果显示,高剂量砷、高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟以及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组与对照组相比,Olive尾矩值明显升高(P<0.05);与对照组比较,高剂量砷、高剂量氟、低剂量砷+高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟以及高剂量砷+高剂量氟联合染毒组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);高剂量砷、高剂量氟、高剂量砷+低剂量氟及高剂量砷+高剂量氟联合组Bax蛋白表达量明显增高,而高剂量砷染毒组Bcl-2蛋白表达量则明显下降(P<0.05);氟砷联合对大鼠海马神经细胞活力、氧化应激损伤、DNA损伤及凋亡率的影响不呈现协同效应(P>0.05)。3)实验结果显示,细胞内Ca2+含量随氟染毒剂量的增加而降低,50μmol/L氟化钠染毒组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,50μmol/L氟化钠染毒组海马神经元细胞中Ras和Raf-1蛋白表达均明显下降,MEK和ERK1/2磷酸化水平亦明显下降(P<0.05),Ras和Raf-1 mRNA表达亦下调(P<0.05),而ERK1和ERK2 mRNA表达无明显改变(P>0.05);10μmol/L亚砷酸钠染毒组Ras和Raf-1蛋白表达及MEK磷酸化水平无明显差异(P>0.05),但ERK1/2磷酸化水平明显下降(P<0.05),Ras、Raf-1、MEK、ERK1和ERK2 mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,10μmol/L亚砷酸钠、50μmol/L氟化钠及10μmol/L亚砷酸钠+50μmol/L氟化钠联合染毒组CREB蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05),BDNF蛋白的表达量亦明显降低(P<0.05),CREB mRNA表达虽然有所下调,但差异无统计学意义(P>0.05);交互作用分析结果显示,氟砷联合对大鼠海马神经细胞BDNF蛋白表达的影响呈现协同效应(P<0.05);与对照组相比,各染毒组C-FOS mRNA表达均有所下调,其中,10μmol/L亚砷酸钠染毒组表达差异有统计学意义(P<0.05);各氟、砷染毒组与对照组相比,C-JUN mRNA表达无明显差异(P>0.05);10μmol/L亚砷酸钠组和10μmol/L亚砷酸钠+50μmol/L氟化钠联合染毒组DNMT1 m RNA表达上调,加入ERK信号通路激动剂NGF预处理海马神经细胞后DNMT1 m RNA表达下调(P<0.05)。结论:氟、砷可透过血脑屏障在大鼠脑组织中蓄积,引起脑组织细胞形态学变化及DA含量下降,并导致大鼠学习记忆能力下降;氟、砷可降低大鼠海马神经细胞的总抗氧化能力,引起细胞DNA损伤及凋亡率升高,这可能是氟、砷对动物学习记忆能力产生影响的重要原因;氟、砷可致Ras/ERK信号通路中ERK磷酸化水平降低,并介导CREB磷酸化水平下降,进而导致BDNF mRNA及蛋白表达下调,这可能是氟、砷成大鼠海马神经细胞损伤并最终影响大鼠学习记忆能力的作用机制之一;氟砷联合对大鼠学习记忆能力的影响不呈现交互作用,表明氟、砷对动物学习记忆能力的影响机制可能不同;DNA甲基化可能参与砷对ERK信号通路的影响过程,其作用机制有待进一步深入研究。