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蟾酥(Bufonis Venenum)为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥分泌物。药理实验和临床研究表明，蟾酥有抗肿瘤、强心利尿、升压、镇痛、抑菌抗炎等生物活性。本实验利用反复柱层析及重结晶法从蟾酥中分离得到10个强心苷类单体化合物。它们分别是蟾毒灵(CS-1，bufalin)、华蟾酥毒基(CS-2，cinobufagin)、脂蟾毒精(CS-3，resibufagin)、蟾毒它灵(CS-4，bufotalin)、华蟾毒它灵(CS-5，bufotalin)、沙蟾毒精(CS-6，arenobufagin)、远华蟾毒精(CS-7，telecinobufagin)、脂蟾毒配基(CS-8，resibufogenin)、日蟾毒它灵(CS-9，gamabufotalin)、5β-羟基蟾毒它灵(CS-10，5β-hydroxylbufotalin)。本实验还建立了蟾酥中脂蟾毒精(resibufagin)和5β-羟基蟾毒它灵(5β-hydroxylbufotalin)的含量测定方法，并对不同批次的蟾酥药材中这两种化合物含量进行了测定。一、强心苷类化合物的提取、分离和结构鉴定1、提取将0.7Kg蟾酥粉末，用80%乙醇回流提取三次，乙醇用量均为15倍。合并提取液，过滤，回收，得乙醇提取物0.29Kg。2、分离纯化将0.29Kg提取物，进行硅胶柱层析，TLC检测，得A、B、C、D四部分。B部分进行硅胶柱层析，得到的B1、B2两部分，其中B1部分经ODS柱层析得到单体化合物CS-1，B2部分经ODS柱层析得到单体化合物CS-2，CS-8。C部分进行硅胶柱层析，得到C1至C9共9部分，其中C4部分经重结晶得到单体化合物CS-3，C6部分进行ODS柱层析，得到单体化合物CS-4、CS-5，C9部分进行ODS柱层析，得到单体化合物CS-6、CS-7。D部分进行硅胶柱层析，得到D1至D9共9部分，其中D5部分重结晶，晶体进行ODS柱层析，得单体化合物CS-9；重结晶母液回收后用进行硅胶柱层析和ODS柱层析，得单体化合物CS-10。3、结构鉴定结合MS、NMR等波谱学数据和化合物的理化性质，并参照文献，鉴定了10个单体化合物的结构，分别为蟾毒灵(CS-1，bufalin)、华蟾酥毒基(CS-2，cinobufagin)、脂蟾毒精(CS-3，resibufagin)、蟾毒它灵(CS-4，bufotalin)、华蟾毒它灵(CS-5，cionbufotalin)、沙蟾毒精(CS-6，arenobufagin)、远华蟾毒精(CS-7，telecinobufagin)、脂蟾毒配基(CS-8，resibufogenin)、日蟾毒它灵(CS-9，gamabufotalin)、5β-羟基蟾毒它灵(CS-10，5β-hydroxylbufotalin)。二、HPLC法测定蟾酥中两种蟾毒配基类化合物的含量1、仪器和色谱条件高效液相色谱仪：Agilent1200HPLC-VWD检测器色谱柱：Agilent HC-C8(4.6×150mm,5μm)色谱条件：流动相：乙腈-水(0.2%醋酸)(21:79)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：296nm；进样量：20μL。2、方法学考察2.1线性关系化合物CS-10、CS-3分别在0.1~4.0μg和0.08~16.0μg进样范围内具有良好的线性关系。线性回归方程和相关系数分别为：CS-10：y=15280x-11.297R2=0.9997CS-3: y=17261x-44.962R2=0.9997y:：峰面积(mAUs)；x：进样浓度(mg/ml)。2.2精密度取CS-10、CS-3浓度分别为0.05mg/mL、0.2mg/mL的混合标准溶液，在上述色谱条件下，考察日内精密度、日间精密度。实验结果显示：CS-10的日内和日间精密度RSD值分别为0.86%，0.79%；CS-3的日内和日间精密度RSD值分别为1.01%，0.82%。结果表明，实验仪器的日内及日间精密度良好。2.3定量限和检测限在本实验条件下，CS-10的定量限为25ng，检测限为8.0ng；CS-3定量限为20ng，检测限为5.0ng。2.4重复性取同一批次蟾酥药材，按供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液，分别测定CS-10、CS-3的含量，结果显示CS-10、CS-3含量的RSD值分别为1.19%和0.86%，表明实验重复性良好。2.5稳定性将供试品溶液每间隔2h测定一次，连续12h，测定CS-10、CS-3峰面积，计算RSD值。结果CS-10峰面积RSD值为0.46%， CS-3峰面积RSD值为0.44%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。2.6加样回收率化合物的CS-10平均加样回收率为99.0%，RSD值为2.3%；化合物的CS-3平均加样回收率为101.0%，RSD值为1.8%。结果表明，回收率良好。3、含量测定取不同批次蟾酥样品，分别测定化合物CS-10，CS-3的含量，结果表明，化合物CS-10的平均含量为0.269mg/g，化合物CS-3的平均含量为1.29mg/g。4、总结本文对蟾酥的化学成分进行了研究，共分离鉴定了10个单体化合物，同时首次建立了蟾酥药材中脂蟾毒精和5β-羟基蟾毒它灵的HPLC含量测定方法。为蟾酥药材质量标准的完善以及蟾酥资源的开发利用提供了科学依据。