多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)为球状或短杆状的革兰阴性菌,根据其荚膜血清型可以被分为A、B、D、E和F共5个血清型,根据菌体抗原可以分为1~16个血清型。从2006年至今,主要危害我国肉牛产业的是牛源A型多杀性巴氏杆菌(牛源PmA)。牛源PmA是一种条件致病菌,主要引起犊牛肺炎和成年牛呼吸道综合征。目前国内对于牛源A型多杀性巴氏杆菌病的防控措施还十分有限,每年因为该病导致了巨大的经济损失,严重危害肉牛产业发展。该病在兽医临床上主要表现为明显的肺部病变,可能因为肺部细菌定殖密度显著高于其它感染脏器。而造成该现象的其中一个原因可能是感染后的肺部中某些物质含量与其它感染脏器存在显著差异。通过将感染后的肺部与其它感染脏器的物质组成进行对比,也许就能找到影响该疾病的关键物质。为了找到潜在的作用物质,本研究首先使用牛源A型多杀性巴氏杆菌(PmCQ2)建立了不同攻毒途径的小鼠肺炎模型。基于该模型,本研究测定了各脏器细菌定殖密度,利用代谢组技术对感染后的小鼠肺部和肝脏组织间差异物质进行分析,再通过体外试验找到能影响牛源PmA感染的物质,最后通过外源添加的方式来检验该物质是否能影响宿主感染过程,探究该物质对细菌和宿主的潜在作用。具体结果如下:1.小鼠牛源A型多杀性巴氏杆菌肺炎感染模型的建立及各脏器定殖情况1.1不同攻毒途径均能成功建立小鼠肺炎模型本研究使用了10~4CFU的PmCQ2分别通过模拟自然感染途径(滴鼻感染)和非自然感染途径(肌肉和腹腔感染)对小鼠进行攻毒。综合小鼠的死亡率、临床表现、肺部病理变化以及肺部HE染色结果来判断是否成功建立小鼠肺炎模型。结果显示:PmCQ2的致死率极高;小鼠感染PmCQ2以后会出现较明显的呼吸道症状,且肺部会出现如牛肺部一样的肝变;HE染色结果显示三种途径下均能导致肺部固有组织结构损伤,并出现牛肺部感染类似的中性粒细胞为主的炎性病变。上述结果证明,自然感染途径和非自然感染途径均能成功建立小鼠牛源PmA肺炎感染模型。1.2 PmCQ2感染后在小鼠肺部定殖密度最高本试验进一步研究了PmCQ2经三种攻毒途径在小鼠体内各脏器(肺、肝、脾和肾脏)的定殖密度,并通过PCR对PmCQ2进行了验证。结果显示,不同途径感染具有菌血症现象;在滴鼻感染(模拟自然感染)途径下PmCQ2能够在各脏器中定殖,且各脏器细菌定殖密度随着时间的增长逐步上升。PmCQ2在肺部的定殖密度要显著地高于其它脏器;在肌肉和腹腔攻毒(非自然感染)途径下PmCQ2也能够在各脏器中定殖,各脏器细菌定殖密度同样随时间增长而上升。肺部细菌定殖密度显著高于肝脏和肾脏,与脾脏定殖密度无显著性差异,但考虑到脾脏的血滤功能会影响定殖结果,故依然认为肺部定殖密度较其它脏器更高。综上,PmCQ2感染后在小鼠肺部定殖密度最高。2.代谢组学分析及差异代谢物质的筛选2.1代谢组学分析利用非靶向代谢组学技术对8只感染PmCQ2后的小鼠肺脏和肝脏代谢产物进行测定;利用统计学软件对本次代谢组学结果进行质量分析,并对差异物质进行了筛选。结果显示,本次代谢组学分析的两组样品之间差异性显著,绝大部分样品都处于95%的置信区间,OPLS-DA模型准确且稳定,说明本次代谢组学分析结果稳定可信,所得数据适合进一步分析。本次检测共筛选到253种差异物质,有99种能够匹配到数据库中。2.2 L-抗坏血酸和L-天冬氨酸能影响牛源PmA生长利用细菌生长分析仪Bactrac4300筛选能影响PmCQ2生长的差异物质。再利用筛选到的物质在体外制作PmCQ2的生长曲线,并通过平板计数的方式确定作用大小。结果显示,仅L-抗坏血酸和L-天冬氨酸能影响PmCQ2的生长。在代谢组学结果中,L-天冬氨酸在感染后的肺脏中更多,对PmCQ2生长起剂量依耐性的促进作用;相反,L-抗坏血酸在感染后的肝脏中更多,对PmCQ2生长起剂量依耐性的抑制作用,并在2mg/mL时起到了杀菌作用。上述结果显示,L-抗坏血酸对牛源PmA的生长具有强大的抑制作用,而L-天冬氨酸对牛源PmA具有促进作用,两者在各自脏器中的含量与细菌定殖密度成正相关。3.外源添加L-抗坏血酸和L-天冬氨酸在牛源A型巴氏杆菌感染中的作用3.1 L-抗坏血酸和L-天冬氨酸能影响牛源PmA相关毒力基因表达为了研究L-抗坏血酸和L-天冬氨酸对细菌毒力的影响,本研究对PmCQ2的一些毒力基因和生物膜形成进行了检测。结果显示,低浓度L-天冬氨酸能促进PmCQ2部分毒力相关基因的表达和生物膜形成;而L-抗坏血酸能够抑制OmpA和oma87毒力相关基因的表达及生物膜的形成。此外,感染后的肺脏中OmpA表达量要显著性高于感染后的肝脏。因此,L-天冬氨酸可能会增强牛源PmA毒力,而L-抗坏血酸能抑制牛源PmA毒力。3.2感染PmA会影响L-抗坏血酸和L-天冬氨酸代谢为了研究感染过程中L-抗坏血酸和L-天冬氨酸的代谢是否发生变化。本研究测定了感染后小鼠肝脏内源L-抗坏血酸产生基因Gulo的表达量和感染前后L-抗坏血酸组织含量,以及感染后肺部L-天冬氨酸代谢通路相关基因表达量。结果显示,不同感染途径下小鼠肝脏Gulo基因的表达量发生了下调,感染前后肺部L-抗坏血酸水平也发生了下调,L-天冬氨酸代谢发生了富集。上述结果表明,在感染后小鼠内源性L-抗坏血酸合成发生了抑制;小鼠肺部L-天冬氨酸代谢在感染后会发生显著性变化。3.3添加外源L-抗坏血酸对小鼠具有保护作用为研究外源L-抗坏血酸和L-天冬氨酸在动物水平对PmCQ2感染的影响,本研究测定了添加外源L-抗坏血酸和L-天冬氨酸后小鼠肺部脏器定殖量和小鼠生存曲线。结果显示,与对照组相比,添加L-抗坏血酸后降低了小鼠肺部PmCQ2定殖密度,提高了小鼠生存率;添加L-天冬氨酸不能影响小鼠肺部PmCQ2定殖密度和生存率。上述结果显示,添加外源L-抗坏血酸能降低小鼠肺部PmCQ2定殖,对小鼠具有保护作用。3.4 L-抗坏血酸加强巨噬细胞对PmCQ2的吞噬杀伤作用为了研究L-抗坏血酸和L-天冬氨酸对巨噬细胞对PmCQ2吞噬杀伤作用的影响。本研究首先通过添加不同剂量的L-抗坏血酸和L-天冬氨酸来判断其对小鼠原代腹腔巨噬细胞的活性是否有影响,随后选择适当浓度处理巨噬细胞,测定巨噬细胞对PmCQ2的吞噬杀伤作用。结果显示,低浓度L-抗坏血酸能够提高小鼠腹腔巨噬细胞活性;100μg/mL的L-抗坏血酸能显著提高巨噬细胞对PmCQ2的吞噬杀伤能力;L-天冬氨酸不会抑制细胞活性,也不影响巨噬细胞对PmCQ2的吞噬杀伤能力。结果表明,添加L-抗坏血酸能增强巨噬细胞对PmCQ2的吞噬杀伤作用。综上所述,本研究发现PmCQ2感染小鼠后会在多个脏器定殖,其中肺部定殖密度最高。通过比较不同定殖密度的脏器发现,感染后肝脏较多的L-抗坏血酸(抑制)和肺部较多的L-天冬氨酸(促进)均能影响PmCQ2的生长。添加外源L-抗坏血酸能抑制PmCQ2毒力,提高巨噬细胞吞噬杀伤能力,给动物起到保护作用,可作为牛源A型多杀性巴氏杆菌病防控的潜在候选物。