肺癌（Lung cancer）是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。据国际癌症研究署（IARC,International Agency for Research on Cancer）统计,2012年全球肺癌新发病例为182.5万人;因肺癌死亡人数为159.0万人。在我国,2015年最新统计数据表明肺癌新发肺癌病例为733,300例,其中男性509,300例,位列第一,女性224,000例,仅次于乳腺癌;肺癌直接导致死亡病例610,200例,其中男性432,400例,女性177,800例,均位列所有恶性肿瘤死亡之首。近年来,随着烟草消耗量增加、环境污染加重、人口老龄化进程加快等问题出现,肺癌已经成为危害我国居民健康的严重公共卫生问题。因此,加强肺癌病因学和发病机制研究,筛选高效、特异、敏感的生物标志物用于高危人群筛选,实现肺癌的早诊早治,显得尤为重要。流行病学资料显示,肺癌是环境因素、生物因素、遗传因素以及表观遗传因素等共同作用的结果。烟草暴露被认为是肺癌发生最主要的环境危险因素,据估计,肺癌患者中80%以上的男性和至少50%的女性可归咎于烟草暴露,但是在相同的烟草暴露下,只有不到20%的人群最终发展为肺癌,提示人群对肺癌的遗传易感性存在个体间差异。近年来,随着以高通量芯片为基础的全基因组关联研究（Genome-wide association study,GWAS）和以二代测序（Next-Generation Sequencing,NGS）为基础的高通量测序研究相关技术的不断发展和成熟应用,大大促进了肺癌等肿瘤基因组学研究的进展。GWAS策略作为研究肺癌易感基因的重要手段,其通过多阶段研究设计筛选出肺癌相关遗传标志物,可用于解析肺癌的遗传易感性,进一步筛选肺癌高危人群,指导肿瘤个体化预防。近年来,GWAS的研究策略在众多复杂性疾病的遗传易感性关联研究中取得了丰硕的成果。自2008年第一个肺癌GWAS发表以来,截止到2017年,研究人员通过肺癌GWAS已经发现了45个肺癌遗传易感区域,包括1p36,2q23,3q28,5p15,5q31,5q32,6p21,6p22,6q24,10p14,10q25,12q23,13q12,13q13,15q25,17q24,18p11,19q13,20q13,22q12等区域。2017年,Amos研究团队利用“Illumina Onco Array”芯片技术,完成了迄今为止最大样本（29,266名肺癌患者和56,450名健康对照）的欧美人群肺癌全基因组关联研究,共鉴定出18个肺癌易感位点,其中10个新发现的易感位点中,4个位点与总体肺癌遗传易感性相关（1p31.1,6q27,8p21和15q21.1区域）,6个位点与肺腺癌遗传易感性特异相关（15q21,8p12,10q24,20q13.33,11q23.3和9p21.3区域）。该研究识别出多个新的影响肺癌发病风险的基因及位点,部分解释了肺癌的“遗传度缺失”（missing heritability）现象。针对以上GWAS研究识别出的遗传变异区域,前期已有相关研究利用直接影响本体基因的功能学手段对易感基因的调控机制展开探讨。然而,大部分遗传位点还缺乏有效的功能机制去解释它们是如何影响肺癌发生的。既往研究发现基因表达调控机制存在多样化。其中表观遗传修饰（Epigenetic modification）调控基因表达的机制研究日趋成为研究热点。表观遗传修饰是指不改变基因DNA序列的情况下,所有细胞减数分裂或有丝分裂在表型或基因表达上的可遗传性改变,主要包括组蛋白修饰（Histone modification）,DNA甲基化修饰（DNA methylation）,RNA甲基化修饰（RNA methylation）和染色质重塑（Chromatin remodeling）等。表观遗传修饰除了在转录调控水平上,还能在转录后水平调控和翻译水平的调控方面对基因表达调控起到重要作用。研究发现N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m~6A）是真核生物中最常见、内源性最丰富的RNA转录后修饰。既往研究已经证明m~6A可以参加多种生物学功能过程,比如转录剪切、细胞核内RNA的输出、控制蛋白质翻译和决定细胞命运等,与m~6A相关的疾病或性状包括肥胖、早期胚胎发育、性别决定、不孕不育以及肿瘤发生等。m~6A修饰在调节基因表达方面起到重要作用,其动态调节一般通过m~6A甲基转移酶和脱甲基酶等之间的相互作用来介导。前期研究已经证实m~6A修饰相关酶基因在肿瘤发生发展中发挥重要作用,如白血病、乳腺癌、肝癌等。此外,通过m~6A测序研究发现了其特有的基序RRACH（R:A/G,H:A/C/U）,该基序高度保守且主要富集在m RNA的终止密码子、3’UTR和m RNA外显子区域。然而,目前关于m~6A修饰与肺癌相关的研究屈指可数,m~6A修饰相关区域遗传变异与肺癌易感性间的探讨也尚未见报道。本研究拟在多个人群中开展m~6A相关遗传变异与肺癌遗传易感性的关联研究。主要研究设计、研究对象和方法如下:（1）在全基因组范围内根据m~6A已知motif RRACH（R:A/G,H:A/C/U）,标记m~6A相关区域,然后,利用1000 Genomes Project（1KG,2015,phase3）数据库,构建m~6A基序区域数据库。（2）对4个肺癌GWAS数据库（12,843名肺癌患者和12,639名健康对照）,进行合并分析,选取4个库共有位点进行质量控制（详细标准见正文方法部分）。通过对m~6A相关区域的遗传变异进行logistics回归分析以及多重校正,获得m~6A相关区域内与肺癌易感性显著关联的遗传位点。然后使用连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）分析和条件分析（conditional analyse）对发现位点对应遗传区域进行独立信号的识别,并进行亚组分析观察位点效应在不同病理类型和不同人种间是否存在差异。（3）结合m~6A公共数据库m6Avar和Rmbase,进一步识别与肺癌发生相关的m~6A遗传区域。在此基础上,使用ENCODE数据库对识别的m~6A区域相关遗传变异及其高LD位点（r~2>0.8）进行功能注释,使用GTEx V7数据库进行e QTL（expression Quantitative Trait Loci）分析,使用The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据进行基因的差异表达分析。（4）对鉴定出的m~6A相关靶基因在肺癌细胞系A549进行功能学机制的探讨。首先使用CCK8细胞增殖实验和克隆形成实验检测遗传变异相关靶基因对细胞增殖改变和克隆形成变化的影响,然后敲低3个主要的m~6A甲基转移酶（METTL3,METTL14和WTAP）,观察靶基因蛋白表达水平的改变情况。主要研究结果:（1）根据m~6A已知基序,本研究获得m~6A相关区域遗传位点2,181,706个,同时在以上区域获得249,465个SNPs;（2）多个GWAS数据库进行合并分析。对m~6A相关区域存在的12,025个遗传变异进行logistics回归分析和多重校正后(Bonferroni P=4.16×10-6),最终获得4个SNPs:rs4246215（11q12.2）,rs10790248（11q23.3）,rs869638（11q23.3）和rs1805（11q23.3）与肺癌易感性显著关联。为对以上4个位点对应遗传区域进行独立信号的识别,本研究进一步进行了连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）分析和条件分析（conditional analyse）,结果显示:位于11q23.3区域的3个遗传位点（rs10790248,rs869638,rs1805）相互之间均为高LD关系（r~2>0.8）,独立信号可由rs869638代表。而11q12.2区域的位点rs4246215与以上3个位点为弱LD关系（r~2<0.2）。为了进一步分析位点是否在不同人种和病理类型中存在差异,本研究分亚洲人群和欧洲人群进行了亚组分析。结果显示,在亚洲人群中,位点rs869638(MPZL3,C>G:OR=1.10,95%CI=1.05-1.17,P=3.87×10-4)与肺腺癌易感性显著关联,与肺鳞癌无显著关联(P=1.98×10-1)。提示rs869638与亚洲人群肺腺癌易感性关联更为显著。位点rs4246215在腺癌(G>T:OR=0.9,95%CI=0.85–0.96,P=4.23×10-4)和鳞癌(G>T:OR=0.86,95%CI=0.78–0.94,P=8.34×10-4)样本中均与肺癌易感性显著关联;（3）本研究首先使用m6Avar和Rmbase数据库进行功能注释,发现rs869638(C>G:OR=1.09,95%CI=1.05-1.13,P=2.27×10-6)位于经实验验证的m~6A位点附近,而rs4246215不位于已知的m~6A位点区域。考虑到rs869638可能影响到m~6A修饰水平的改变,因此下步分析重点关注rs869638所在的相关信号。随后,为了分析rs869638所在染色体11q23.3区域的功能,本研究对rs869638进一步进行功能注释,关联分析结果发现11q23.3区域存在唯一独立的关联信号。利用ENCODE数据库功能注释结果发现,rs869638及其高LD位点均不位于其相关的MPZL3基因的启动子或者增强子区域。进一步,e QTL分析发现,rs869638风险等位基因型G可以下调MPZL3的m RNA表达。然而,TCGA数据差异表达分析显示,相对于癌旁组织,MPZL3在癌组织基因高表达,这与e QTL分析结果不相符。以上研究提示:在该区域rs869638可能不是通过单纯的e QTL方式调控MPZL3基因的RNA表达从而影响肺癌易感性的。而m~6A修饰可能是其潜在的调控机制。（4）本研究在肺腺癌细胞系A549中进行功能验证。首先对MPZL3基因进行表型实验,结果证明MPZL3高表达会增加肺腺癌细胞增殖和克隆形成能力。然后敲低METTL14会显著诱导MPZL3表达水平上升。因此我们认为MPZL3是一个与肺腺癌相关的易感基因并且受到m~6A修饰调控。我们的研究提示rs869638可能通过改变该区域m~6A基序从而影响m~6A水平,继而影响易感基因MPZL3的表达水平。综上所述,本研究首先在全基因组范围内基于m~6A基序定义m~6A相关区域。然后对4个GWAS数据库进行合并分析并筛选出m~6A相关区域内4个与肺癌易感性显著相关的遗传变异rs4246215（11q12.2）,rs10790248（11q23.3）,rs869638（11q23.3）和rs1805（11q23.3）。根据m~6A公共数据库识别出m~6A相关区域位点rs869638和其调控的靶基因MPZL3,发现在肺腺癌中易感性位点rs869638可以通过改变m~6A基序序列,下调m~6A水平从而导致MPZL3表达水平上升。本研究是首次利用GWAS数据和m~6A公共资源进行系统分析,这为解释已知易感基因或位点的潜在机制提供了更多线索。