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脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),是烧伤、创伤和感染性疾病患者的常见并发症。流行病学资料显示,每年全球有超过1800万的脓毒症病例,且患者数目每年以1.0%速度递增。重症脓毒症和脓毒性休克是重症监护病房(intensive care units, ICU)病人死亡的首要因素,死亡率高达50%-60%。内毒素(endotoxin/Lipopolysaccharide, LPS)是G-菌外膜的主要成分,是介导细菌脓毒症的重要病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。LPS进入机体内后,首先与内毒素结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein,LBP)结合,在LBP的作用下,LPS与单核/巨噬细胞膜上的受体CD14结合形成LPS-CD14复合物,复合物中的LPS与跨膜受体TLR4(Toll like receptor 4,TLR4)结合,将信号转入胞内,导致靶细胞的活化,释放TNF-α、IL-6等炎症介质,介导脓毒症的发生。尽管对脓毒症的病理生理机制及其防治策略的研究较为深入,但至今仍无特殊有效的药物供临床治疗。中草药在脓毒症中的应用具有悠久的历史,已证实多种中草药具有较好的拮抗内毒素作用,但由于中药成分复杂,加之缺乏有效的分离检测手段,限制了中草药在脓毒症防治中的应用与发展。在前期的研究中,我们将LPS的活性中心Lipid A包被于生物传感器上,建立了以Lipid A为靶点的筛选拮抗LPS药物的实验平台。基于此技术平台,本研究采用大孔吸附树脂、超滤膜分离和高效液相色谱(high performance liquid chromatogram, HPLC)技术,对中药水提液进行多级分离纯化,以期从天然药物中获取具有拮抗LPS活性的单体化合物,为脓毒症防治药物的研发提供新的思路和方法。方法1.应用以Lipid A为靶点的生物传感器技术平台,检测60种中药水煎液与Lipid A的结合活性;对明确具有与Lipid A结合活性的中药,采用大孔吸附树脂分离技术、超滤膜技术和HPLC技术进行分离提取,应用生物传感器进行活性追踪监测,收集能与Lipid A结合的组分,并对其进行针对LPS的体内外生物学活性评估。对活性明确的有效组分,用HPLC作进一步的分离纯化,选择与Lipid A具有较高结合活性的HPLC产物作进一步的研究,对所得单体化合物进行纯度分析和结构解析。2.对得到的单体化合物进行针对细菌脓毒症的体内外生物学活性评价,包括:①鲎试剂法检测单体对LPS的体内外中和作用;②ELISA法检测单体对LPS刺激巨噬细胞产生细胞因子(TNF-α和IL-6)的抑制作用;③RT-PCR法检测单体对LPS诱导巨噬细胞TLR4和TNF-αmRNA表达的影响;④观察单体化合物对脓毒症模型小鼠的保护作用。结果1.应用生物传感器技术平台,从60种中药中筛选出黄芩、胡连、赤芍、五倍子、诃子等5种具有与Lipid A较高结合活性的中药(RU>200 arc seconds)。以黄芩为研究对象,从黄芩水提液中分离出与Lipid A具有结合活性的组分SbG-4;SbG-4 (40mg/kg)能显著提高热灭活大肠埃希氏菌攻击小鼠72h的存活率;物质属性鉴定SbG-4为黄酮类物质。应用膜分离技术从SbG-4中分离出分子量小于5000Da的5KL,5KL经HPLC分离获得5个HPLC组分(5KL-1～5);在5个组分中,以5KL-1与Lipid A的结合活性最高;在体外5KL-1对LPS具有直接中和作用、可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α,体内评价显示5KL-1对脓毒症模型小鼠具有显著的保护作用;5KL-1经HPLC进一步分离后,得到5KL-1A、5KL-1B和5KL-1C三个产物;其中仅5KL-1B是单一物质并与Lipid A的结合活性最高,纯度分析显示,5KL-1B的纯度因子为999.685;经质谱、核磁、红外等波谱分析,对5KL-1B的结构指认为2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇(2’, 5, 6’, 7-tetrahydroxy-flavanonol, THF),分子式为:C15H12O7。2.对THF的活性研究显示:①、THF在体内外对LPS均具有直接中和作用;②、THF能够显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6,并具有明显的量效关系;③、THF对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和TNF-α在mRNA水平的表达均具有显著的抑制作用;④、THF对致死剂量热灭活大肠埃希氏菌攻击的小鼠具有显著的保护作用。结论应用现代生物技术从黄芩中定向分离出2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇;2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇在体内外对LPS均具有拮抗作用,对脓毒症模型小鼠具有保护作用。