污蝇杆菌（Wohlfahrtiimonas chitiniclastica）是一种需氧、革兰阴性短杆菌,系条件性致病菌,可侵袭动物机体并引起化脓性病症,呈世界性分布。近年来,有关污蝇杆菌感染的报道逐年增多。2012年,在我国首次从上海浦东国际机场的大头金蝇（Chrysomyia megacephala）体内成功分离到污蝇杆菌。2016年,从山东某养殖场患蹄冠炎的奶牛的病变部位分离获得1株污蝇杆菌。2017年,另一株污蝇杆菌从吉林省某肉牛场育肥牛的眼睑化脓病变部位被成功分离。2019年,江苏省某养牛场多只患腐蹄病的奶牛化脓病灶内再次成功分离获得1株污蝇杆菌。本研究从2018年送检的样品中首次分离到1株猪源污蝇杆菌,通过单菌落的多代纯化,革兰氏染色镜检,扫描电镜观察,生化试验,基因组测序及小鼠致病性等实验对该菌进行了系列鉴定研究,并建立了该菌的PCR检测方法,为污蝇杆菌的临床监测和病原学的进一步研究奠定了基础。1、污蝇杆菌的分离与鉴定2018年贵州省普安县某猪场送检了2只全身多处呈现化脓病灶的患病仔猪,解剖可见肺脏粘连、脾头肿大及典型“绒毛心”病症,呈典型的HPS混合感染病症。在使用TSA培养基增菌检测HPS过程中,经16S r RNA PCR扩增测序发现该混合增菌液中存在污蝇杆菌。混合增菌液经平板划线,挑选疑似菌落进行多代纯化后,通过16S r RNA PCR扩增测序、革兰氏染色、生化特性检测等实验初步鉴定后,进一步对纯化菌进行了扫描电镜观察和全基因组测序鉴定,同时对该菌进行了培养特性研究、药敏试验、小鼠致病性试验等研究。送检患病仔猪病原检测结果显示,存在CSFV、PRRSV、HPS以及污蝇杆菌的混合感染。纯化的污蝇杆菌（Wohlfahrtiimonas chitiniclastica CN/Guizhou/426）16S r RNA PCR序列与NCBI中污蝇杆菌16S r RNA序列的核苷酸相似性为95.2%～97.5%,与Wohlfahrtiimonas chitiniclastica India/I5属于同一个遗传进化分支,遗传关系较近。该菌系革兰氏阴性杆菌、呈短杆状,在TSA固体培养基上呈淡灰色、圆形、光滑、隆起且边缘整齐的菌落,对明胶液化、卫矛醇、果糖等均呈阴性反应,对丙三醇、吲哚、尿素等呈阳性反应,基本符合变形杆菌的生化反应特征。扫描电镜结果显示,该菌菌体平均长度×平均宽度为1.30μm×0.53μm,菌体表面及边缘光滑清晰,无鞭毛和荚膜,呈两端粗壮且钝圆的短杆状菌。全基因组测序结果显示,该污蝇杆菌大小为2 434 026 bp,GC含量为36.08%,基因预测显示该菌包含2 398个基因,2 309个蛋白质编码区和54个t RNA。培养特性试验显示,其在TSA固体培养基、LB固体培养基、血液琼脂平板、麦康凯培养基上污蝇杆菌均能生长,在高盐培养基上不生长。污蝇杆菌在含5%胎牛血清的TSB液体培养基37℃培养24 h,每毫升中活菌数为1.22×10~9CFU/m L。药物敏感性试验结果显示,该菌对氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林等14种药物敏感,对青霉素、苯唑西林、头孢哌酮等15种药物耐药,对新霉素中介。小鼠致病性试验显示,腹腔分别注射0.5 m L 500倍、100倍、10倍CFU浓缩菌液的小鼠在6 h、12 h、24 h死亡,通过细菌16S r RNA通用引物对其进行菌血症检测及脏器细菌检测,结果表明所得序列与本试验分离纯化的污蝇杆菌核苷酸相似性为100%。2、污蝇杆菌PCR检测方法的建立参考污蝇杆菌的细菌16S r RNA基因序列,选择保守序列区设计并合成引物,通过优化退火温度、退火时间、引物浓度、延伸时间等,成功建立了污蝇杆菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏性、特异性、可重复性进行了评价。该方法总体系为25μL。其中,最佳反应体系为:金牌Mix（Green）21μL、上游/下游引物各1μL（浓度20 pmol/μL）、细菌DNA模板2μL。最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性50 s,61℃退火30 s,72℃延伸15 s,循环35次;72℃终延伸10 min。该方法对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌及本实验室部分混合菌核酸不产生扩增反应,检测污蝇杆菌的灵敏度为1.25×10-3copies/μL,可重复性良好。