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目的构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)标记的人降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-related Peptide,CGRP)重组腺病毒(Adenovirus, Ad)载体(Ad5-CGRP-EGFP),建立大鼠降主动脉-腹主动脉同种异体移植血管病变(Allograft vasculopathy,AV)模型,研究降钙素基因相关肽转基因对同种异体移植血管病变的防治作用,进一步探讨其作用机制。方法1通过质粒提取、测序鉴定降钙素基因相关肽基因,利用细菌内质粒间同源重组法构建EGFP标记的重组腺病毒载体Ad5-CGRP-EGFP。2采用Lewis和F344大鼠,取供体降主动脉植入受体肾下腹主动脉,建立大鼠同种异体移植血管病变的动物模型。3实验随机分为F344组、同基因组、异基因组、EGFP组、CGRP组。CGRP组供体转染Ad5-CGRP-EGFP后,植入受体肾下腹主动脉,EGFP组供体转染Ad5-EGFP,同基因组和异基因组供体未转基因,分别于术后4周、8周取标本,行组织病理学观察移植血管病理变化,冰冻切片、荧光显微镜观察基因转染情况,放免测定血管组织CGRP变化,免疫组化观察CGRP表达强度和部位。4免疫组化观察VCAM-1、iNOS的表达,TUNEL法细胞凋亡检测血管组织细胞凋亡情况。结果1鉴定降钙素基因相关肽基因后,利用细菌内质粒间同源重组法成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-CGRP-EGFP。2成功建立大鼠同种异体移植血管病变模型。3 CGRP组术后4周冰冻切片、荧光显微镜观察显示移植血管中膜、外膜均可见绿色荧光,组织病理观察显示内膜无明显增厚,CGRP组放免测定移植血管组织CGRP显示CGRP有统计意义的高于其他分组,免疫组化观察显示移植血管外膜CGRP等级有统计意义的增高,其他分组未见类似情况。CGRP组术后8周仅见放免测定移植血管组织CGRP有统计意义的高于EGFP组和异基因组。4 CGRP组术后4周组织病理观察显示移植血管形态学上大致正常,内膜尚光滑,中膜弹力层完好,外膜见淋巴细胞、炎细胞和巨噬细胞浸润,CGRP组管腔闭塞指数较异基因组和EGFP组低,而异基因组和EGFP组出现从内膜增厚到管腔闭塞等不同程度病理变化;CGRP组术后8周组织病理观察显示移植血管形态学也出现不同程度病理变化,但管腔闭塞指数仍较异基因组和EGFP组低;同基因组则术后4周及术后8周移植血管形态学上大致正常,仅见少量淋巴细胞侵润。5 TUNEL法细胞凋亡检测结果显示CGRP组术后4周移植血管内膜、中膜和外膜AI均较异基因组和EGFP组内膜、中膜和外膜有统计意义的降低;CGRP组术后8周移植血管内膜、中膜和外膜AI与异基因组和EGFP组内膜、中膜和外膜相比均无统计意义。6免疫组化显示,CGRP组术后4周移植血管内膜、中膜和外膜VCAM-1的表达均较异基因组和EGFP组内膜、中膜和外膜有统计意义的降低;术后8周则无统计意义。iNOS的免疫组化表达在CGRP组术后4周仅内膜较异基因组和EGFP组内膜有统计意义的降低,其他均无统计意义。结论1本研究证实利用细菌内同源重组法成功构建腺病毒载体Ad5-CGRP-EGFP,为进一步研究降钙素基因相关肽基因治疗奠定了基础。2大鼠降主动脉-腹主动脉同种异体移植血管病变模型的建立,成功地复制了同种异体移植血管病变,为开展同种异体移植血管病变的研究提供了良好的平台。3 CGRP基因转染成功。4 CGRP基因成功转染有效地防治了AV,其机制是移植血管组织CGRP基因转染表达后,CGRP升高,通过抑制VCAM-1等途径,抑制了淋巴细胞、巨噬细胞和炎细胞的浸润,进一步抑制了iNOS的产生,减少了移植血管细胞凋亡,移植血管组织得到保护、免遭排斥。