论文部分内容阅读
大豆作为我国的主要农作物,长年受到生物或非生物胁迫,前人关于盐碱、干旱等非生物胁迫已有颇多的报道,但有关生物胁迫的研究较少。大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode,简称:SCN)病是主要生物胁迫病害之一,侵染植株严重。因此,如何防治SCN已逐渐成为科学家研究的重点。传统的防治方法为轮作或者种植抗病品种,但传统方法容易导致线虫产生适应性,因此随着基因工程技术的发展,筛选抗性基因并培育抗性植株成为主要防治手段并取得成效。肌醇磷酸合成酶(MIPS)催化葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)生成肌醇-1-磷酸,此步骤为真核生物肌醇合成的限速步骤。肌醇参与植物体中多种代谢途径,并且与植物细胞壁的生物合成密切相关,肌醇可以通过自身氧化代谢途径生成参与细胞壁合成的多糖:木聚糖以及果胶。由此推断,调控MIPS基因的表达水平可增强大豆细胞壁的合成用于抵抗线虫的侵染。在大豆基因组上发现MIPS基因,命名为GmMIPS,其基因家族包括四个基因。本试验选择抗病品种灰皮支黑豆、哈尔滨小黑豆、小粒黑豆以及感病品种辽豆15,分别在SCN三号生理小种(SCN3)侵染后的不同时间段取样,提取RNA并反转录为cDNA,利用荧光定量PCR检测SCN侵染后GmMIPS1和GmMIPS2的表达分析,构建瞬时表达载体以及GmMIPS基因编码蛋白的亚细胞定位,为后续功能研究奠定基础。主要研究结果如下:1.通过生物信息学检测GmMIPS1和GmMIPS2基因长度为1533bp,编码511个氨基酸,二者均为稳定性亲水蛋白质,分别具有38和39个磷酸化位点,具有较强的磷酸化能力。MIPS基因属于肌醇合成的上游基因,参与肌醇生物合成并属于肌醇磷酸化途径。在常见的15种植株中,与GmMIPS亲缘关系最近的是菜豆和绿豆,亲缘关系最远的是玉米和小麦。2.通过酸性品红染色发现SCN3可以侵染抗感病大豆植株根部并定植于此,继续发育为三龄、四龄幼虫,同时发现SCN3侵染感病植株的数量明显多于抗病品种,说明抗病植株存在某种抗性机制可以抵抗线虫侵染。3.利用反转录PCR(RT-PCR)技术,分别从大豆抗病品种灰皮支黑豆、哈尔滨小黑豆、小粒黑豆以及感病大豆品种辽豆15中克隆出长度为1533bp的GmMIPS1和GmMIPS2基因。利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术明确了在SCN3胁迫下,抗感大豆品种中GmMIPS1和GmMIPS2基因的表达量变化规律。结果发现:三种大豆抗病品种在SCN3侵染10 dpi(days post inoculation)后GmMIPS1和GmMIPS2的表达量均上升并高于在感病品种辽豆15中的表达量,说明目的基因在10 dpi发挥抗性作用来抵御线虫的发育。4.选取抗病大豆品种中表现显著差异的实验组cDNA为模板,成功构建细菌克隆载体pMD19-GmMIPS1和pMD19-GmMIPS2,随即与融合过表达载体pCAMBIA1303连接,成功构建植物过表达载体pCAMBIA1303-GmMIPS1和pCAMBIA1303-GmMIPS2。5.通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统,在本生烟叶片中瞬时表达GmMIPS1和GmMIPS2蛋白。利用激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白GFP的位置,试验结果表明:阳性对照组荧光均匀分布在细胞上,阴性对照中无荧光,GmMIPS1蛋白和GmMIPS2蛋白荧光主要分布在细胞膜或者细胞壁上。