猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科,基因组为单股正链RNA,具有快速变异特性。自1991年首次分离获得病毒以来,该病毒基因逐渐发生变化并伴随着给养猪业带来严重经济损失。2000年美国出现非典型PRRSV,免疫商品猪群和母猪群出现严重死亡。PRRS于1996年在我国首次爆发,并逐渐传播各省市。2006年在中国大陆地区多省份出现高致病性PRRS,主要临床表现为持续高热(41.0℃以上)、皮肤发红、发病率和死亡率高。病毒非结构蛋白NSP2上存在30个氨基酸缺失。近年来,PRRSV持续流行,造成了我国养猪业的巨大经济损失。为了深入阐明该病毒基因遗传变异规律和NSP2毒力作用,探索该病毒新的免疫防控方法,本研究从华东地区部分省份2004-2009年发病猪群分离获得38株PRRSV,并对其NSP2基因高变异区进行了克隆和序列分析；根据基因分析结果,从中选择4株PRRSV流行毒株进行仔猪人工感染发病试验,研究NSP2基因变异与病毒毒力间的关系；同时,设计构建共表达PRRSV GP3和GP5与猪粒细胞巨噬细胞集落细胞刺激因子(Granulocyte/macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)融合蛋白重组腺病毒,并进行了小鼠和猪体免疫试验,具体研究内容和结果分为以下5个部分：1.我国猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株分离与鉴定2004-2009年在临床流行病学研究基础上,从江苏、上海、山东、安徽、浙江和广西等省市收集临床发病猪场仔猪肺脏病料,经匀浆、冻融和过滤处理后接种Macr-145或猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过CPE观察、RT-PCR检测和PRRS阳性抗体间接免疫荧光试验鉴定,分离获得38株PRRSV,其中,32株病毒直接采用Macr-145细胞分离获得,其余6株病毒则是先用PAM细胞分离,然后接种Marc-145细胞分离获得；分离病毒在Marc-145细胞上培养特性有一定差异,病毒毒价为103.75-106.33TCID50/ml,为PRRSV研究提供了重要物质基础。2.2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株NSP2基因遗传变异分析根据PRRSV NSP2基因设计合成2对PCR引物,采用巢式RT-PCR方法对上述分离的38株PRRSV NSP2基因高变区进行克隆和测序分析,结果显示：不同毒株PCR扩增产物长度有所不同,共出现5种长度类型,分别为：1215、1275、1287、1373和1374bp。38株PRRSV核苷酸同源性为71.6%-99.6%,推测的氨基酸同源性为63.7%-98.3%。NSP2基因进化分析结果显示,38株分离株可以分为两个基因亚型,即NSP2基因亚型Ⅰ和NSP2基因亚型Ⅱ,其中,NSP2基因亚型Ⅰ内的毒株有28株,具有30个或更多个氨基酸的缺失,基因同源性为92.9%-99.2%;NSP2基因亚型Ⅱ内的毒株具有1个或不具有氨基酸的缺失,但基因差异较大,基因同源性为76.5%-99.6%。根据NSP2基因高变区基因缺失情况,38株PRRSV分离株分为5种类型,其中,30aa缺失型毒株比例最高(26/38),2种新的NSP2基因缺失类型的PRRSV毒株出现于2008年后。该研究结果表明,我国PRRSV流行毒株NSP2基因变异较大,并不断出现新的变异毒株,加强PRRSV流行毒株基因变异监测十分必要。3.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因变异与毒力变化间的关系研究根据上述PRRSV NSP2基因序列分析结果,选择4个PRRSV毒株,包括YX0907、BB0907、SY0909和NT0801毒株,其中,YX0907、BB0907和SY0909毒株属于基因亚型Ⅰ,具有30个氨基酸缺失的特征,NT0801属于NSP2基因亚型Ⅱ,其NSP2上不存在缺失。GP5基因序列分析结果为：4株PRRSV毒株GP5基因同源性为98.0%-99.8%,其氨基酸同源性为97.5%-99.5%。选择23头45日龄PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌(HPs)阴性健康商品仔猪,随机分为5组,第1-4组分别颈部肌肉注射上述4株PRRSV分离株(第3代),2×10432TCID50/1ml/头,第5组3头猪作为空白对照,隔离饲养21d,每天测量体温,观察临床症状；攻毒后第7d、14d和21d采血分离血清,测定PRRSV含量；对死亡猪和第21天处死猪进行病理解剖,观察肉眼病理变化和组织病理变化,并进行记分和比较,结果显示,BB0907毒株毒力最强,试验猪感染后体温明显升高,临床症状明显,可引起3/5死亡,病猪肺脏组织具有明显病理变化；YX0907毒株毒力较强,试验猪临床症状和病理变化明显,可引起2/5死亡；NT0801毒力较弱,部分猪感染后出现1-2d体温升高和轻度临床症状,但未引起死亡；SY0909毒株毒力最弱,感染猪出现1-3d体温升高,临床症状不明显,病理变化较轻；而对照组猪无临床异常表现和病理变化。该研究结果表明,PRRSV分离株毒力存在明显差异,4个毒株毒力高低为：BB0907> YX0907> NT0801> SY0909。具有NSP2相同基因缺失类型的3个PRRSV分离株毒力差异较大,证实PRRSV毒力与NSP2的30个氨基酸基因缺失没有直接联系。4.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3-GP5与猪GM-CSF融合基因重组腺病毒的构建与鉴定利用PCR扩增出高致病性PRRSV SY0608分离株的GP3和GP5基因及猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因,并按顺序将它们连入梭载体pShuttle-CMV,并在GM-CSF和GP3之间及GP3和GP5间分别插入FMDV 2A基因和"AAGCTT"连接子,重组穿梭载体经酶切和测序鉴定后用PmeⅠ线性化,然后电转化入基因工程菌株大肠杆菌BJ5183内,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1重组,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化,然后用脂质体法转染HEK-293A细胞,10d后获得重组腺病毒,命名为rAd-GF35。用RT-PCR方法检测,可以扩增获得长度约1.8kb的GM-CSF-GP3-GP5融合表达转录产物；用猪抗PRRSV阳性血清和小鼠免疫原核表达猪GM-CSF蛋白获得的血清进行间接免疫荧光试验(IFA),证明该重组腺病毒在293A细胞中可以表达GM-CSF和GP3-GP5目的蛋白；用Western blot检测,结果显示GM-CSF-GP3-GP5融合蛋白能够正确表达,且抗原性良好；猪骨髓细胞用感染rAd-GF35的PK-15细胞上清刺激,可以表现明显增殖并形成集落。该研究结果证明,本研究构建的重组腺病毒rAd-GF35可以有效表达GM-CSF-GP3-GP5重组蛋白,并具有GM-CSF生物活性。5.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3-GP5与猪GM-CSF融合基因重组腺病毒小鼠免疫特性研究取60只BALB/c小鼠,随机分为4组,每组15只。第1和第2组分别背部皮下注射PBS缓冲液和野生型腺病毒(wtAd)作为对照组,第3和第4组分别于背部皮下注射重组腺病毒rAd-GP35(表达GP3-GP5融合蛋白)和rAd-GF35(表达GM-CSF-GP3-GP5融合蛋白),接种剂量为1010TCID50/0.5ml/只,隔离饲养3周后用同样方法加强免疫一次。首次免疫后不同时间,随机抽取5只／组采血和取脾脏,分别检测PRRSV特异抗体、淋巴细胞增殖指数、IFN-y和IL-4,结果为：第3-4组小鼠在免疫后21d,均可以检测到PRRSV特异ELISA抗体产生,42d达到最高,抗体水平差异显著(P<0.05)；首次免疫后42d, rAd-GF35免疫组抗体最高可达1：128,平均效价为1:80,显著高于rAd-GP35免疫组(1:32)(P<0.05);同时,rAd-GF35免疫组小鼠淋巴细胞增殖指数(Stimulation Index,SI)平均值显著高于rAd-GP35免疫组(P<0.05); rAd-GF35免疫组小鼠脾细胞经PRRSV抗原体外刺激后,细胞培养上清中IFN-γ平均含量为175pg/ml, IL-4平均含量为87.3 pg/ml,而rAd-GP35免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的含量只有117.3 pg/ml和46.5pg/ml,差异显著(P<0.05)。该结果表明,重组腺病毒rAd-GF35诱导的体液免疫和细胞免疫明显高于重组腺病毒rAd-GP35, GM-CSF可以显著增强GP3/GP5蛋白在小鼠体内的免疫反应。6.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3-GP5与猪GM-CSF融合基因重组腺病毒仔猪免疫保护效力研究取15头2周龄的PRRSV, PCV2和HPs阴性健康商品仔猪,随机分为3组,每组5头,隔离饲养。第1和第2组肌肉注射重组腺病毒rAd-GF35和rAd-GP35,第3组同样方法接种野生型腺病毒(wtAd)作为对照,接种剂量为5×10.0TCID50/1ml/头,间隔3周后用同样方法加强免疫一次,免疫后不同时间采血,测定ELISA抗体和猪外周血淋巴细胞(PBMC)增殖指数SI；首免后42d用PRRSV-SY0608强毒滴鼻,2×104.0TCID50/1ml/头,每个鼻孔1 ml,攻毒后分别观察临床症状、PRRSV病毒血症和病理变化,并进行综合记分和比较,结果为：免疫后21d,重组腺病毒rAd-GP35和rAd-GF35组ELISA抗体水平显著高于wtAd, rAd-GF35组中和抗体水平最高可达1:10,平均效价1:7.6,而rAd-GP35免疫组最高为1:8,平均效价<1:5;免疫后42d, rAd-GF35免疫组PBMC增殖指数SI平均值显著高于rAd-GP35免疫组(P< 0.05); rAd-GF35免疫组猪血清中IFN-γ与IL-4含量为276.2 pg/ml和312.7 pg/ml,显著高于rAd-GP35免疫猪血中的94.6 pg/ml和242.5pg/ml (P< 0.05).攻毒后,rAd-GF35免疫组临床症状明显减轻,综合评定数值为26.2,显著低于rAd-GF35免疫组的44和wtAd组的82.2(P<0.05)；攻毒后7d, rAd-GF35、rAd-GP35和wtAd组猪血清病毒含量分别为1.5×1030、3.3×1030和1.0×1040个TCID50,三个组间差异显著(P<0.05)。此外,对照组猪攻毒后出现明显病理变化,包括肺脏出血、炎性浸润和肺泡损伤等,其次为rAd-GP35,而rAd-GF35无明显病理变化。该研究结果证明,rAd-GF35免疫可以提供仔猪较好免疫保护作用。综上所述,我国流行PRRSV毒株发生了新的变异,多种NSP2基因缺失类型病毒株同时存在,丰富了PRRSV分子流行病学资料；人工感染发病试验进一步证实,NSP2基因缺失与病毒毒力间没有直接关系；用腺病毒表达的GM-CSF-GP3-GP5能够在小鼠和猪体内诱导PRRSV特异性体液和细胞免疫反应,证实GM-CSF能够显著增强GP3-GP5的免疫反应,提高对仔猪的攻毒保护,从而为PRRSV新型疫苗研究奠定了基础。