杜氏盐藻(Dunaliella salina, D. salina)是一种高度耐盐的单细胞真核绿藻,可在氯化钠浓度为0.05 M～5M的环境中生存,是迄今为止所发现的最耐盐的生物之一。围绕杜氏盐藻进行耐盐机制的研究已经引起广泛关注,并且一些盐适应相关蛋白也已经被陆续分离、鉴定。尽管盐藻的基因组信息非常有限,但蛋白质组学方法却提供了一种分离盐藻盐适应相关蛋白非常有效的技术手段。许多参与糖代谢的酶都已经被证实参与了植物的盐胁迫应答过程,同时这些糖代谢相关的酶在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)和盐藻以及果蝇(Drosophila)等模式生物中也被证实跟它们的运动、感觉器官-鞭毛/纤毛具有相关性。鞭毛和纤毛是细胞表面的特化细胞器,形态和结构相似,在不同的物种中具有高度保守性。除了具有典型的运动功能,纤毛/鞭毛在生物的感官和生长发育过程中也发挥至关重要的作用,在多种组织细胞中其结构和功能相关基因的缺失或突变可能导致多种疾病的发生。最近的一些研究表明纤毛可能在肿瘤细胞中起重要作用,一些重要的信号通路如：Hedgehog (Hh)、Smoothened和Wnt似乎都跟鞭毛成分相关。葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase, GPI)广泛存在于真核生物、原核生物和一些古细菌中,催化糖酵解和糖异生过程中葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的相互转化,而且是“进化学说”的证据之一。在哺乳动物细胞中,除了作为糖代谢的关键酶它还具有细胞因子的功能,能够通过和它的受体结合来促进细胞的运动。相关的研究证实杜氏盐藻GPI在盐藻的鞭毛功能中可能发挥作用,但它是否具有细胞因子功能尚不清楚。本研究中我们通过不同盐浓度培养杜氏盐藻,利用蛋白质组学方法获得了盐藻的差异表达图谱,分离出了21种在高盐诱导条件下蛋白表达增加达到3倍的蛋白并通过质谱分析鉴定出其中的12种蛋白,包括糖代谢的关键酶GPI(DsGPI);为了进一步验证其在分子水平也参与了盐胁迫的过程,我们通过快速扩增cDNA末端(Rapid amplification of cDNA end, RACE)技术得到了DsGPI基因cDNA全长,利用原核表达验证该cDNA的正确性,同时通过实时荧光定量分析该基因在高盐和光照诱导条件下的变化情况；由于杜氏盐藻GPI具有和哺乳动物GPI相似的结构和一些相同的关键酶活位点,我们将杜氏盐藻GPI转染MDCK细胞验证其是否具有和人GPI相似的细胞定位,转染食管鳞癌细胞验证其是否具有和人GPI相似的促进肿瘤细胞运动的能力。结果显示,DsGPI不但在分子水平而且蛋白水平都参与了盐胁迫的过程,在高盐诱导条件下二者的表达量均明显升高。杜氏盐藻GPI转染MDCK细胞后和人GPI(AMF)具有相似的细胞定位：主要集中的细胞核区域；同时Western blot结果也证实杜氏盐藻GPI能够在食管鳞癌细胞中稳定过表达,而且能够增强食管鳞癌细胞的侵袭能力,提示其可能也具有细胞因子功能。为进一步探讨DsGPI作为细胞因子影响癌细胞增殖、凋亡以及其鞭毛/纤毛中的定位提供了实验基础。方法1第一部分杜氏盐藻盐适应蛋白的蛋白质组学研究1.1杜氏盐藻藻株的鉴定取适量藻细胞混合液轻涂于半固体培养基培养板上,培养10～14天至板上长出单藻落,随机挑选60个单藻落转接于试管中培养。7-10天后在显微镜下观察藻体形态,要求大小均一。分别选取体积较大和体积较小的藻细胞扩大培养,生长至对数生长期后提取DNA并设计引物扩增内部间隔序列(internal transcribed space,ITS),测序后根据比对结果确定纯化的杜氏盐藻藻株。1.2双向电泳分离不同盐浓度培养下的杜氏盐藻总蛋白三氯醋酸-丙酮沉淀法提取1.5 M和3.5 M NaCl培养的杜氏盐藻总蛋白,Brandford法进行蛋白定量。分别取400μg和800μg在等电点pI范围为3～10的24cm胶条上进行第一向等电聚焦,然后通过SDS-PAGE进行第二向电泳,并分别用硝酸银和考马斯亮蓝R250染色。1.3双向电泳图谱分析和质谱鉴定高盐诱导条件下增强表达的蛋白二维凝胶分别经硝酸银和考马斯亮蓝R250染色并显色后,用Image-Scanner进行图像扫描获得凝胶图像,经ImageMaster 2D Platinum software凝胶图像分析软件进行图像调整、蛋白点检测、蛋白点匹配和数据分析后结合肉眼观察,确定差异表达的蛋白质点；在匹配的蛋白质点中选取在高盐条件下表达量增加达到3倍的蛋白点,从凝胶上挖下,胰酶消化后,经基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),通过软件搜索蛋白质数据库并结合生物信息学方法鉴定蛋白质点。2第二部分杜氏盐藻GPI基因cDNA的克隆、表达和功能分析2.1杜氏盐藻GPI基因cDNA全长的克隆根据质谱鉴定获得的DsGPI的肽段信息,结合其它物种中GPI氨基酸的保守性分析,设计兼并引物,RT-PCR获得DsGPI基因cDNA片段；根据片段序列信息,利用3’RACE和5’RACE的方法分别向3’下游和5’上游扩增杜氏盐藻GPI基因的3’和5’cDNA末端片段；将上述片段拼接得到DsGPI基因cDNA全长,然后设计引物PCR扩增全长,测序后进行核苷酸和氨基酸的生物信息学分析。2.2杜氏盐藻GPI基因cDNA全长的原核表达将在两端添加适当酶切位点的杜氏盐藻GPI cDNA编码序列定向克隆于原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,筛选并测序鉴定重组质粒。转化E-coliBL21,并用IPTG诱导DsGPI融合蛋白在BL21中表达。SDS-PAGE后,对DsGPI融合蛋白在大肠杆菌BL21中的表达进行分析。2.3杜氏盐藻GPI基因的功能分析将对数生长期的盐藻置于暗环境中培养24小时后进行光照培养,以继续在暗环境培养的盐藻为对照,分别在0,1,2,4,8,12,16,20和24小时取样并提取RNA,实时荧光定量PCR分析DsGPI基因在光诱导条件下的变化趋势；取对数生长期的盐藻分别接入新鲜1.5 M、2.5 M和3.5 M NaCl培养基中,分别在0,1,2,4,6,8,10和12小时取样并提取RNA,实时荧光定量分析DsGPI基因在盐诱导条件下的变化趋势。3第三部分杜氏盐藻GPI基因对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响3.1杜氏盐藻GPI多克隆抗体的制备利用Ni-NTA组氨酸亲和柱纯化原核表达的DsGPI融合蛋白,免疫新西兰白兔制备DsGPI多克隆抗体,并利用间接ELISA进行效价评测和Western blots进行抗体特异性分析。3.2杜氏盐藻GPI在MDCK细胞中的定位构建EGFP-C1-DsGPI真核表达载体并利用脂质体转染细胞,同时以EGFP-C1-GPI、EGFP-C1空载体转染的细胞及未处理的细胞为对照,荧光显微镜观察杜氏盐藻GPI在MDCK细胞中的定位。3.3杜氏盐藻GPI对食管鳞癌细胞EC9706侵袭能力的影响以pcDNA3.1(+)质粒为基础,分别构建pcDNA3.1(+)-DsGPI和pcDNA3.1(+)-GPI质粒并转染EC9706细胞,同时以pcDNA3.1(+)空质粒转染的细胞和未经处理的细胞为对照,Western blots鉴定重组质粒在EC9706细胞中的蛋白表达情况,然后利用Transwell小室试验检测EC9706细胞侵袭能力变化。4统计学处理Western blots结果采用TotalLab2.0软件分析,同一实验均重复三次以上。用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,行单因素方差分析(one-way ANOVA), P<0.05具差异性。结果1第一部分杜氏盐藻盐适应蛋白的蛋白质组学研究1．1杜氏盐藻藻株的鉴定从半固体培养基上挑取的单个藻细胞经在试管中培养后,形态均一,无互相混合；以体积较大和体积较小的藻DNA为模板,用ITS引物分别扩增出长度～600bp和～1100 bp的片段；经测序并比对后证实体积较大的藻为杜氏盐藻(Dunaliella salina UTEX 1644),体积较小的藻为(Dunaliella viridis);后续的实验以体积较大的纯净的杜氏盐藻藻株为研究对象。1.2双向电泳分离不同盐浓度培养下的杜氏盐藻总蛋白TCA-丙酮沉淀法提取的杜氏盐藻总蛋白能够有效的去除盐藻中的色素等成分,并且易溶解于上样缓冲液；等电聚焦过程中电压上稳定上升并且均达到了预期的8000 V,说明样品处理符合条件；二维凝胶染色后Image-Scanner扫描获得的凝胶图像清晰,蛋白质点均匀,重复性好；1.3双向电泳图谱分析和质谱鉴定高盐诱导条件下增强表达的蛋白经ImageMaster 2D Platinum software凝胶图像分析软件后共检测到803个蛋白点,共匹配739对,匹配率为92.1%；在这些匹配的蛋白质点中有21个蛋白点在3.5 M NaCl的条件下增强表达达到3倍以上,这些蛋白点并被选择进行下一步的质谱鉴定；所选择的21个蛋白经质谱分析和数据库比对后,有9个未能找到理想的匹配对象,剩余的12个均被鉴定,包括：葡萄糖-6-磷酸异构酶,铁-超氧化物歧化酶,ATP合成酶,热休克蛋白70B,30S核糖体蛋白S4,反转录转座子蛋白(retrotransposon protein),动力蛋白1-α重链,G蛋白,钙依赖性蛋白激酶,乙醇脱氢酶和2个暂未命名的蛋白。2第二部分杜氏盐藻GPI基因cDNA的克隆、表达和功能分析2.1杜氏盐藻GPI基因cDNA全长的克隆利用兼并引物扩增得到771 bp长的DsGPI基因cDNA片段,3’RACE和5’RACE分别得到了687 bp和1206 bp的片段,去除重叠区域后得到了全长为2338 bp的序列,此序列中包含一个1980 bp长的开放阅读框；此阅读框对应的659个氨基酸长度序列经BLAST分析后显示其与其它物种的GPI具有很高的同源性,说明克隆的序列就是杜氏盐藻的GPI基因cDNA序列。2.2杜氏盐藻GPI基因cDNA全长的原核表达杜氏盐藻的GPI cDNA编码序列定向克隆于原核表达载体pET-28a(+)后转染大肠杆菌株BL21,经IPTG诱导后成功表达DsGPI融合蛋白。SDS-PAGE结果表明：在～78 kD出现一条特异性条带,而对照组无此特异条带,说明所克隆得到的杜氏盐藻GPI cDNA序列正确。2.3杜氏盐藻GPI基因的功能分析实时荧光定量PCR分析显示,DsGPI基因在光诱导的前2个小时其表达量会迅速下降,而后又恢复到正常水平并维持相对稳定；而在高盐诱导条件下,DsGPI基因的表达在开始的前2个小时有所下降而后迅速升高并且分别在3.5 MNaCl诱导16小时后到达峰值,此时其表达量增至14倍；在2.5 M NaCl诱导20小时后到达峰值,此时其表达量增至8倍。3第三部分杜氏盐藻GPI基因对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响3.1杜氏盐藻GPI多克隆抗体的制备经Ni-NTA组氨酸亲和柱纯化的DsGPI融合蛋白其纯度高达96.3%；间接ELISA检测到该多抗的效价高达1：256 K～1：512 K,同时Western blots条带单一,说明该抗体具有特异性。3.2杜氏盐藻GPI在MDCK细胞中的定位荧光显微镜观察显示转染EGFP-C1-DsGPI和EGFP-C1-GPI质粒的MDCK细胞在细胞核区域富集有绿色荧光蛋白,而EGFP-C1空载体转染的细胞在胞质中均匀分布绿色荧光蛋白,未经处理的细胞无绿色荧光显现,说明杜氏盐藻GPI具有和人GPI (AMF)相同的细胞定位。3.3杜氏盐藻GPI对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响Western blots结果显示转染pcDNA3.1(+)-DsGPI的EC9706细胞其GPI的表达分别是用pcDNA3.1(+)空质粒转染细胞和未经处理的细胞中GPI的表达量的2.2±0.06倍(P<0.05)和1.9±0.13倍(P<0.05),转染pcDNA3.1(+)-GPI质粒的EC9706细胞其AMF的表达量分别是用pcDNA3.1(+)空质粒转染细胞和未经处理的细胞中AMF的表达量的3.3±0.11倍(P<0.05)和3．0±0.19倍(P<0.05)；560 nm的OD值数据分析显示转染pcDNA3.1 (+)或未进行转染的细胞其OD值分别为2.64±0.06和2.47±0.10,而转染pcDNA3.1-DsGPI和pcDNA3.1-AMF的细胞其OD值分别提高到3.86±0.14(P<0.05)和4.18±0.11(P<0.05),提示DsGPI具有和AMF促进肿瘤细胞侵袭的相似功能。结论1.本实验分离、纯化并鉴定了杜氏盐藻藻株,获得了形态均一的杜氏盐藻细胞,为以杜氏盐藻为材料进行研究奠定了可靠的基础；获得了杜氏盐藻在高盐诱导条件下的差异蛋白表达图谱,在蛋白质组水平对盐藻盐适应蛋白进行了初步分离；利用质谱分析了21个在高盐诱导条件增强表达达到3倍的蛋白点并鉴定出了其中的12种蛋白,获得这些蛋白的部分肽段序列,为进一步详细研究这些蛋白和基因功能提供了相关信息。2.克隆得到杜氏盐藻GPI的cDNA序列,全长2338 bp,包含一个1980bp的开放阅读框并通过原核表达进行了验证；通过实时荧光定量PCR证实该基因的表达受光和高盐条件所诱导,而且盐浓度越高诱导效果越强,在分子水平证实DsGPI参与了高盐诱导,进一步验证了蛋白质组学的研究结果；利用纯化的原核表达蛋白成功制备了效价高、特异性强的盐藻GPI多克隆抗体。3.构建杜氏盐藻GPI的真核表达载体,转染MDCK细胞后证实：杜氏盐藻GPI和人GPI (AMF)一样,都定位在细胞核；盐藻GPI也能在EC9706细胞中表达,Transwell小室证实,盐藻GPI具有跟人GPI相似的细胞因子功能,能够提高EC9706细胞的侵袭能力；杜氏盐藻GPI促进肿瘤细胞侵袭运动的功能,为进一步探讨盐藻GPI在体外对肿瘤细胞增殖、凋亡以及对体内肿瘤发生、发展的影响以及其在盐藻鞭毛/纤毛中的定位奠定了基础。