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研究目的
角膜作为直接与外界空气接触的组织，对环境中的污染物十分敏感。流行病学调查显示，空气污染可对角膜上皮及泪膜等眼表组织结构造成损伤。由于现代人群每日多数时间居于室内，故而室内污染对眼表健康的影响越来越引起人们的重视。油烟是室内污染的主要来源之一，其中反式，反式-2,4-癸二烯醛(trans, trans-2,4-decadienal, tt-DDE)是油烟中含量最丰富的致突变醛类，除可通过每日的烹饪过程释放于室内空气中之外，在加热的油脂类食物及食品添加剂中也广泛存在。既往研究已证实暴露于tt-DDE对人类健康有不良影响，但这些研究多集中于消化系统和呼吸系统，目前尚无其对眼表的损伤作用的研究。基于此背景，本研究以人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cells, HCECs)为研究对象，首次探究tt-DDE对HCECs的作用和机制。
研究方法
首先，对不同浓度或时长tt-DDE处理后的HCECs通过CCK-8试验检测细胞活性，并且于显微镜下观察细胞形态的变化。应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling, TUNEL )检测凋亡细胞比例。应用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)探针检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成。应用JC-1荧光探针法和荧光素酶法分别检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)和细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量。通过免疫荧光染色观察内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)相关蛋白Bip、pIRE1、XBP-1s、pPERK、peIF2α、ATF4和CHOP的定位及表达量变化，并通过蛋白印迹试验(western blot)对其进行定量。
其次，先使用ERstress的两种小分子抑制剂(ISRIB和4-PBA)对HCECs进行6h预处理，再将HCECs暴露于20μMtt-DDE中12h。用同上方法检测细胞活性、凋亡细胞比例、ROS、MMP、ATP含量以及ERstress相关蛋白表达量。
最后，取32只C57BL/6小鼠分为4组，第1组不做处理，第2、3、4组使用20μMtt-DDE每日3次滴眼处理，其中，第3组提前1天开始每日1次腹腔注射ISRIB(2.5mg/kg)，第4组提前1天开始每日1次腹腔注射4-PBA(20mg/kg)。于第15天及30天行眼表荧光素钠染色、裂隙灯显微镜观察并记录眼表情况、记录泪膜破裂时间(tear break up time, TBUT)，并使用酚红棉丝评估泪液分泌量。30天处理结束后，取小鼠眼球行石蜡切片及HE染色，观察角膜上皮层形态变化。
研究结果
本次研究发现，tt-DDE暴露可以引起HCECs浓度依赖性和时间依赖性的细胞活性降低，胞浆空泡化和皱缩的形态学改变，且凋亡细胞比例明显增高。tt-DDE也可导致ROS生成增多、MMP降低、细胞内ATP含量减少。另外，ERstress相关蛋白Bip、pIRE1、XBP-1s、pPERK、peIF2α、ATF4和CHOP均在tt-DDE处理后表达增高，其中部分蛋白(pIRE1、peIF2α)由胞质向核内定位增加。
与单纯暴露于tt-DDE的处理组相比，暴露前使用ERstress抑制剂预处理可明显减轻tt-DDE引起的细胞活性降低、凋亡比例升高、ROS生成过多和线粒体功能障碍。
tt-DDE处理组小鼠在15及30天时均较对照组眼表荧光染色评分高、TBUT明显缩短、泪液分泌量减少，且HE染色显示角膜上皮层变薄。使用ISRIB和4-PBA预处理的小鼠，以上指标较单纯tt-DDE处理组均有明显改善。
研究结论
本研究首次揭示了油烟中化学成分tt-DDE对HCECs的毒性作用。tt-DDE可在HCECs中激活ERstress并引起ROS介导的线粒体功能障碍，进而引发细胞凋亡。ERstress的调节在tt-DDE相关的眼表损伤中有潜在的保护性作用。此外，tt-DDE可破坏小鼠泪膜与角膜上皮，可进一步作为一种干眼模型构建的新方法。
角膜作为直接与外界空气接触的组织，对环境中的污染物十分敏感。流行病学调查显示，空气污染可对角膜上皮及泪膜等眼表组织结构造成损伤。由于现代人群每日多数时间居于室内，故而室内污染对眼表健康的影响越来越引起人们的重视。油烟是室内污染的主要来源之一，其中反式，反式-2,4-癸二烯醛(trans, trans-2,4-decadienal, tt-DDE)是油烟中含量最丰富的致突变醛类，除可通过每日的烹饪过程释放于室内空气中之外，在加热的油脂类食物及食品添加剂中也广泛存在。既往研究已证实暴露于tt-DDE对人类健康有不良影响，但这些研究多集中于消化系统和呼吸系统，目前尚无其对眼表的损伤作用的研究。基于此背景，本研究以人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cells, HCECs)为研究对象，首次探究tt-DDE对HCECs的作用和机制。
研究方法
首先，对不同浓度或时长tt-DDE处理后的HCECs通过CCK-8试验检测细胞活性，并且于显微镜下观察细胞形态的变化。应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling, TUNEL )检测凋亡细胞比例。应用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)探针检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成。应用JC-1荧光探针法和荧光素酶法分别检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)和细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量。通过免疫荧光染色观察内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)相关蛋白Bip、pIRE1、XBP-1s、pPERK、peIF2α、ATF4和CHOP的定位及表达量变化，并通过蛋白印迹试验(western blot)对其进行定量。
其次，先使用ERstress的两种小分子抑制剂(ISRIB和4-PBA)对HCECs进行6h预处理，再将HCECs暴露于20μMtt-DDE中12h。用同上方法检测细胞活性、凋亡细胞比例、ROS、MMP、ATP含量以及ERstress相关蛋白表达量。
最后，取32只C57BL/6小鼠分为4组，第1组不做处理，第2、3、4组使用20μMtt-DDE每日3次滴眼处理，其中，第3组提前1天开始每日1次腹腔注射ISRIB(2.5mg/kg)，第4组提前1天开始每日1次腹腔注射4-PBA(20mg/kg)。于第15天及30天行眼表荧光素钠染色、裂隙灯显微镜观察并记录眼表情况、记录泪膜破裂时间(tear break up time, TBUT)，并使用酚红棉丝评估泪液分泌量。30天处理结束后，取小鼠眼球行石蜡切片及HE染色，观察角膜上皮层形态变化。
研究结果
本次研究发现，tt-DDE暴露可以引起HCECs浓度依赖性和时间依赖性的细胞活性降低，胞浆空泡化和皱缩的形态学改变，且凋亡细胞比例明显增高。tt-DDE也可导致ROS生成增多、MMP降低、细胞内ATP含量减少。另外，ERstress相关蛋白Bip、pIRE1、XBP-1s、pPERK、peIF2α、ATF4和CHOP均在tt-DDE处理后表达增高，其中部分蛋白(pIRE1、peIF2α)由胞质向核内定位增加。
与单纯暴露于tt-DDE的处理组相比，暴露前使用ERstress抑制剂预处理可明显减轻tt-DDE引起的细胞活性降低、凋亡比例升高、ROS生成过多和线粒体功能障碍。
tt-DDE处理组小鼠在15及30天时均较对照组眼表荧光染色评分高、TBUT明显缩短、泪液分泌量减少，且HE染色显示角膜上皮层变薄。使用ISRIB和4-PBA预处理的小鼠，以上指标较单纯tt-DDE处理组均有明显改善。
研究结论
本研究首次揭示了油烟中化学成分tt-DDE对HCECs的毒性作用。tt-DDE可在HCECs中激活ERstress并引起ROS介导的线粒体功能障碍，进而引发细胞凋亡。ERstress的调节在tt-DDE相关的眼表损伤中有潜在的保护性作用。此外，tt-DDE可破坏小鼠泪膜与角膜上皮，可进一步作为一种干眼模型构建的新方法。