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CRISPR/Cpf1是2015年张峰小组报道的新型CRISPR系统,研究证实该系统具有更简单、更精准实现基因组编辑的潜能。解旋酶DDX21不仅能够参与信使RNA（Messenger RNA,mRNA）前体加工、RNA的转运和降解、核糖体的生成等多种生物学过程,而且在禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、登革热病毒（Dengue virus,DENV）、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）等病毒的增殖及信号传导过程中也发挥了重要作用。本研究首先利用CRISPR/Cpf1技术敲除哺乳动物HEK293细胞DDX21基因并感染H9N2亚型AIV,在细胞水平验证了CRISPR/Cpf1系统的活性及DDX21介导AIV感染的天然免疫应答机制;进一步探索了CRISPR/Cpf1慢病毒系统在鸡DF-1细胞和鸡体上的基因编辑,为揭示DDX21基因功能、病毒致病机制研究奠定了基础。CRISPR/Cpf1系统编辑哺乳动物细胞:以DDX21为靶向基因,利用在线软件chopchop筛选靶位点,分别构建pU6-Lb-crRNA-DDX21打靶载体和pcDNA3.1-hLbCpf1-RFP报告载体。将两个载体共同转染HEK293细胞,流式细胞仪分选阳性细胞,T7E1酶切法检测Cpf1核酸酶切割活性为56.8%,经筛选后获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,成功建立以CRISPR/Cpf1系统介导基因稳定敲除的新方法。以构建的HEK293-DDX21-/-为细胞模型,H9N2亚型AIV感染后测定病毒滴度,荧光定量PCR检测模式识别受体、细胞因子、抗病毒蛋白的mRNA表达水平,进一步验证及揭示敲除DDX21基因的功能变化。结果显示:TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及OAS的mRNA表达水平下调,TCID50差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后可能引起DDX21-TRIF-MyD88信号通路受阻,抑制I型干扰素、炎症因子和抗病毒蛋白表达,促进流感病毒复制。CRISPR/Cpf1系统编辑鸡DF-1细胞:根据设计原则,在鸡DDX21基因第2外显子筛选4个靶点,分别将重新构建的4个打靶载体与报告载体共同转染DF-1细胞,T7E1酶切和TA克隆测序发现靶点1切割效率最高为33.3%（10/30）,靶点处存在548bp的缺失。包装Lenti-Cpf1-DDX21慢病毒感染DF-1细胞,嘌呤霉素筛选富集阳性细胞,通过流式细胞仪分选至96孔板中,经测序鉴定后,成功获得2株DDX21基因敲除的DF-1细胞株。基因编辑鸡的探索:慢病毒表达载体与相应的包装质粒按照一定的比例混合后转染至293T细胞,通过ELISA方法测定慢病毒滴度为2.5×107Tu/mL;采用赤道面开窗法,将包装的慢病毒显微注射到527枚新生种蛋的胚盘下腔,孵化得到83只雏鸡,孵化率为15.86%;凝胶电泳鉴定,外源基因整合至鸡基因组中的效率为22.9%（19/83）。本研究成功建立CRISPR/Cpf1介导的HEK293及DF-1细胞的基因敲除方法,通过H9N2亚型AIV感染实验验证DDX21参与的信号通路过程,探索了CRISPR/Cpf1慢病毒系统在鸡体内的基因编辑,对利用CRISPR/Cpf1建立细胞、动物模型和研究基因功能等具有重要的应用价值。