论文部分内容阅读
背景帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病。其主要临床特征是行动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势平衡障碍等；主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性坏死、路易氏(Lewy)小体形成。常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(autosomal-recess ive early parkinsonism，AREP)是指符合常染色体隐性遗传方式，发病年龄小于或等于45岁的帕金森综合征。多巴反应性肌张力障碍(dopa-responsire dystonia，DRD)是一种少见的遗传性锥体外系疾病，由于部分患者可以出现帕金森综合征样表现，与发病年龄较早的AREP在临床上难以区分。parkin、PINK1、DJ-1和ATP13A2基因突变能导致AREP，目前已经发现了包括基因外显子杂合缺失在内的12种DJ-1基因的致病突变。在前期工作中，本研究小组应用聚合酶链反应(PCR)结合DNA直接测序技术对16个AREP家系、3个DRD家系先证者的DJ-1基因进行了突变检测，发现了1个DJ-1基因的复合杂合突变(A39S)。由于DNA直接测序技术不能发现基因外显子的杂合缺失或重复突变，因此为了进一步明确DJ-1基因在本组AREP和DRD患者中的突变频率，有必要应用基因定量方法结合DNA直接测序技术进行DJ-1基因的突变检测。目的建立应用实时荧光定量PCR检测DJ-1基因外显子重排突变的技术平台，结合DNA直接测序技术对本组21个AREP和6个DRD家系先证者进行DJ-1基因突变检测。方法采用实时荧光定量PCR技术检测DJ-1基因外显子重排突变，结合DNA直接测序方法检测DJ-1基因点突变、小片段插入或／和缺失突变。设置ALB基因为内对照，建立DJ-1基因和ALB基因的标准曲线，根据已建立的标准曲线计算DJ-1基因和ALB基因相对于标准品的起始拷贝数，DJ-1基因相对拷贝数为DJ-1基因相对起始拷贝数与ALB基因相对起始拷贝数的比值。结果应用实时荧光定量PCR技术对21个AREP家系和6个DRD家系先证者进行DJ-1基因外显子重排突变检测，发现DJ-1基因各外显子相对拷贝数均在0.8-1.2之间，在目前公认的正常参考范围之内，提示本组患者不存在DJ-1基因各外显子的重排突变。在前期工作的基础上，应用DNA直接测序技术对5个AREP家系和3个DRD家系先证者进行DJ-1基因点突变、小片段插入或／和缺失突变检测，发现了1个DJ-1基因纯合突变：位于DJ-1基因第2号外显子29位碱基T被C替换(T29C)，导致第10位氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸(L10P)；在其余4个AREP家系和3个DRD家系中未发现DJ-1基因突变。发现了DJ-1基因的3个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)，分别为IVS4+30t→g、IVS4+45g→a和IVS4+46g→a。结论建立了应用实时荧光定量PCR检测DJ-1基因外显子重排突变的技术平台，未发现本组AREP家系存在DJ-1基因重排突变。发现本组AREP家系存在1个新的DJ-1基因突变(L10P)，DJ-1基因在本组AREP中突变频率约为9.5％。发现了DJ-1基因的3个SNP，分别为IVS4+30t→g、IVS4+45g→a和IVS4+46g→a。