在反刍动物瘤胃中,细菌脲酶水解尿素生成氨的速率过快,无法与挥发性脂肪酸（碳架）的生成速度匹配,导致氨在瘤胃中不能及时被微生物利用而吸收入血,降低了反刍动物对尿素氮的利用率,严重时造成动物氨中毒,同时污染环境。因此,降低瘤胃细菌脲酶活性在反刍动物营养领域具有研究意义。本文利用同源建模获得高丰度瘤胃细菌脲酶的三维结构,通过基于分子对接的虚拟筛选技术,筛选化合物库并评价其抑制脲酶活性效果。利用酶动力学、瘤胃微生物厌氧培养及Caco-2细胞培养评价化合物的抑制类型、对微生物氮代谢的影响、稳定性及细胞毒性。通过分子对接研究化合物与脲酶的作用模式,通过化合物-靶标蛋白间的药效团模型解析化合物的有效化学基团。为获得瘤胃高丰度脲酶蛋白结构及其抑制剂,以实验室前期获得的瘤胃高丰度脲酶基因为靶标序列,以产气克雷伯氏菌脲酶蛋白为模板,利用SWISS-MODEL server对瘤胃高丰度脲酶蛋白进行同源建模,利用SAVES 5.0对瘤胃脲酶蛋白结构进行合理性评价。结果表明,靶标序列与产气克雷伯氏菌脲酶蛋白（PDB＿ID 4EP8）的氨基酸序列相似度为69.56%。以该蛋白为模板,生成瘤胃脲酶蛋白结构模型的GMQE和QMEAN值分别为0.85与-0.37;ERRAT值为96.9371,Verify3D值为89.38%;其结构中有424个氨基酸残基（占89.6%）落在最适区,44个氨基酸残基（占9.3%）落在允许区,1个氨基酸残基（占0.2%）落在不允许区,且脲酶活性中心中氨基酸均在允许区。表明构建的瘤胃脲酶蛋白结构合理。通过分子对接技术筛选ChemDiv化合物库,最终总共获得了40个候选瘤胃脲酶抑制小分子化合物。为评价筛选化合物的脲酶抑制效果,以瘤胃脲酶活性抑制试验构建筛选模型,并通过酶动力学评价化合物的抑制类型。结果表明,化合物6238-0047与化合物Y041-7877瘤胃脲酶抑制效果最高,IC₅₀值分别为65.86μmol/L与101.4μmol/L。化合物6238-0047及化合物Y041-7877作用下脲酶动力学曲线参数Vmax/Km的比值均发生变化,表明这两个化合物均为混合性脲酶抑制剂。为了评价瘤胃脲酶抑制小分子化合物对微生物氮代谢的抑制能力、稳定性、细胞毒性及瘤胃微生物对化合物的适应性,利用瘤胃微生物厌氧培养法及Caco-2细胞培养法评价化合物对瘤胃微生物氨氮生成及尿素降解的抑制能力、化合物的稳定性、瘤胃微生物对化合物的适应性及细胞毒性。结果表明,化合物6238-0047与化合物Y041-7877在传代培养六代中均能抑制瘤胃微生物厌氧培养体系中氨氮的产生,不存在微生物适应性。同时化合物6238-0047能够抑制瘤胃微生物厌氧培养体系中尿素的降解。化合物6238-0047在传代培养第一代及第六代中的24 h降解率均小于对照脲酶抑制剂乙酰氧肟酸,表明化合物6238-0047稳定性较强。同时以Caco-2为细胞模型的细胞毒性评价亦表明,在浓度为100μmol/L时化合物6238-0047没有细胞毒性。为了获得脲酶抑制小分子化合物与脲酶的作用模式及小分子化合物的有效抑制结构,将化合物6238-0047与化合物Y041-7877分别与相应的脲酶靶标进行分子对接,结果表明,化合物6238-0047分别与Arg335、Asp220形成氢键,同时化合物的羧基也分别与Ala362、Asp359形成2条氢键。此外化合物6238-0047中部的吡咯环结构能与瘤胃脲酶蛋白活性中心的His319位点形成Pi-Pi Stacked作用力,与瘤胃脲酶活性中心外的柔性片状区域的Cys318位点形成Pi-Alkyl作用力。化合物6238-0047的甲氧基苯结构也能与瘤胃脲酶蛋白活性中心的His319位点形成Pi-Pi Stacked作用力。化合物Y041-7877能与His246、His321形成氢键,其苯环结构能与Asp221、Arg336形成Pi-Anion作用力。此外,化合物Y041-7877尾部的杂环结构还能与His320、Phe332形成Pi-Sigma、Pi-Pi stacked作用力。通过“受体-配体-药效团”功能解析化合物结构特征。结果表明化合物6238-0047有2个氢键受体（HBA）、1个疏水基团（HY）、2个氢键供体（HBD）以及1个芳香环（RA）特征。化合物Y041-7877有2个氢键受体（HBA）、1个疏水基团（HY）、1个氢键供体（HBD）以及2个芳香环（RA）特征。本研究以实验室前期获得的瘤胃高丰度脲酶基因簇为靶标,利用同源建模技术获得瘤胃脲酶蛋白活性中心所在亚基的三维结构,并基于分子对接技术构建了一系列筛选与评价模型。从ChemDiv化合物库中筛选获得了能够抑制瘤胃微生物群体氮代谢的小分子化合物6238-0047与化合物Y041-7877。为降低瘤胃中尿素分解速度,提高反刍动物尿素和氨的利用效率,节约饲料蛋白质资源提供技术途径。