蛋白质-多糖相互作用导致的选择性复合现象,是一种独特的分离纯化蛋白的方法。大豆乳清是大豆分离蛋白生产过程中的副产物,将其中的蛋白质回收利用不仅有利于大豆的综合利用,还能减少环境污染。本课题从动力学和热力学角度研究天然带电多糖与大豆乳清蛋白的选择性复合行为,并且对蛋白-多糖复合物的形成机理和控制因素进行详细考察。主要研究结论如下:首先,论文研究了天然阳离子多糖壳聚糖(Ch)与大豆乳清蛋白(SWP)的复合行为,并选择性纯化Kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)。通过控制体系pH达到最大程度复合(pHmax),获得的复合物总量最多,蛋白含量最高,并在蛋白多糖/质量比4:1,pH 6.3条件下获得最高回收率(32%)。Tricine-SDS-PAGE结果表明,四种大豆乳清蛋白中,KTI和Bowman-Birk胰凝乳蛋白酶抑制剂(BBI)参与了复合物形成,而β-淀粉酶和大豆凝集素(SBA)基本不参与,这与壳聚糖较高的p Ka值有关。进一步增加蛋白/多糖质量比至100:1,仅有KTI参与复合物形成,BBI仍然残留于上清中。最终,经过以上与壳聚糖的选择性复合作用,可以从大豆乳清中回收90%以上的KTI,KTI平均纯度为>90%(SEC-HPLC),胰蛋白酶抑制活性(TIA)为5901.3 U/mg。再者,研究了天然阴离子多糖ι-卡拉胶与大豆乳清蛋白的选择性复合行为,并纯化KTI、BBI和大豆凝集素(SBA)。在大豆乳清蛋白/卡拉胶质量比≥5:1条件下,卡拉胶优先与KTI和SBA形成复合物,复合完成后,剩余的卡拉胶分子才开始复合BBI和β-淀粉酶。最终,控制蛋白/多糖质量比为15:1,pHmax为pH 3.57及pH 4.48,可以分别制备得到纯度>90%的KTI和SBA。与此同时,调节蛋白/多糖质量比为10:1,pHmax 3.69,可以制备得到纯化的BBI(纯度约为92.5%),胰凝乳蛋白酶抑制活性(CIA)为690 U/mg。等温滴定量热(ITC)表明,SBA对卡拉胶的亲和常数(43.1±13.1×106 M-1)高于β-淀粉酶(8.39±1.55×106 M-1),而KTI对卡拉胶的亲和常数(14.5±4.03×106 M-1)高于BBI(4.05±1.13×106 M-1)。其次,研究了多糖类型对大豆乳清蛋白选择性复合影响。以KTI-BBI混合物(KBM)为模型体系,详细考察了羧基多糖和硫酸多糖形成复合物的差异性。结果发现,羧基多糖形成的复合物表现复凝聚物结构,而硫酸多糖形成的复合物更类似于“沉淀”,这是因为硫酸多糖电荷密度更高。另外,研究发现,根据多糖电荷密度的大小,纯化BBI所需的多糖相对质量不断升高。硫酸葡聚糖具有最高的电荷密度,因此纯化BBI的多糖用量最少(蛋白/多糖质量比10:1);λ-卡拉胶、硫酸软骨素、海藻酸钠电荷密度中等,在蛋白/多糖质量比5:1时实现BBI纯化;黄原胶电荷密度较低,需要的多糖用量最多(蛋白质/多糖质量比达到2:1)。阿拉伯胶具有最低的电荷密度,蛋白回收率仅为38.1%,KTI和BBI的分离度较低,不能实现选择性纯化BBI。从热力学角度研究了BBI与ι-卡拉胶的热力学结合行为。ITC结果表明,BBI与ι-卡拉胶的热力学结合分为两步结合过程,即放热焓(-ΔH)逐渐增加和逐渐衰减过程。临界摩尔浓度rcritical=400,不受蛋白摩尔浓度、盐浓度和温度的影响,并且静电作用力和非静电作用力(例如疏水作用力)共同参与了蛋白多糖结合过程。BBI结合多种硫酸多糖同样形成两步热力学曲线;BBI结合多种羧基多糖却只能形成典型热力学饱和曲线。将ι-卡拉胶进行酸水解,破坏硫酸基团,水解片段结合卡拉胶分子形成了正常的饱和S型热力学曲线,两步热力学曲线消失。由此可知,BBI–ι-卡拉胶热力学结合是一种硫酸基团依赖型行为。利用壳聚糖(Ch)-卡拉胶(CG)两步复合法从实际生产中的大豆乳清体系选择性纯化蛋白。在低聚糖、非蛋白氮、小肽和矿物盐等物质的存在下,壳聚糖与大豆乳清的复合作用强度显著降低,需要完全转移胰蛋白酶抑制剂所需的壳聚糖用量达到蛋白含量的50%,远高于透析大豆乳清蛋白所需的壳聚糖用量(5%)。壳聚糖分子量的增加可以进一步增加蛋白回收率,蛋白多糖结合常数(Ksv)按照分子量大小依次降低。控制ChSWP复合物与卡拉胶进行第二步复合,KTI和BBI表现出竞争性的结合行为,KTI优先与卡拉胶(ι-,κ-)结合并转移至复合物中,在蛋白质/多糖质量比3:1条件下,纯化的BBI被富集于上清中。最终制备得到的BBI纯度约为92.7%,CIA为669.5 U/mg。最后,利用多种高浓度(4%)阴离子多糖回收大豆乳清蛋白,并组装了剪切装置。结果表明,ι-卡拉胶和硫酸葡聚糖最适合回收大豆乳清蛋白,最佳回收条件为:大豆乳清蛋白/ι-卡拉胶浓度比2:1,pH 3.5,大豆乳清蛋白/硫酸葡聚糖浓度比3:1,pH 3.5,蛋白回收率分别为91%和89.2%。激光共聚焦显微技术(CLSM)观察了剪切前后蛋白质-多糖复合物结构的差异性。剪切前,高浓度多糖与蛋白形成的复合物微观结构分布不均一。剪切后,ι-卡拉胶和硫酸葡聚糖与蛋白形成的复合物为明显的聚集体形态(≥100μm),数量较多;海藻酸钠和黄原胶形成的复合物呈絮状或丝绵结构,无聚集体粒子;阿拉伯胶和羧甲基纤维形成的复合物粒子十分微小,或者不存在,无法形成相分离。利用小规模超滤装置成功分离了蛋白与多糖。实验表明,采用截留分子量为100 k Da的超滤装置,可以截留超过90%的多糖,同时透过75%–80%的蛋白分子。