年龄因素对人牙周膜干细胞生物学行为影响的研究

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目的通过检测不同年龄阶段来源人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的增殖能力、衰老状况、成骨分化能力、成脂分化能力等的变化,探讨年龄因素对人牙周膜干细胞生物学行为的影响,为老年牙周病患者的临床治疗及预测、牙周组织重建干细胞疗法等提供理论基础和参考依据。方法选取三个不同年龄组供体来源的hPDLSCs,分别为A组(年龄18-20岁来源)、B组(年龄30-35岁来源)、C组(年龄50-55岁来源),对三组hPDLSCs进行扩增和观察,并对P2代hPDLSCs进行后续传代培养及检测。使用MTT法检测各组hPDLSCs在不同时间段的增殖情况,通过比较各组干细胞的增殖曲线而比较其增殖率,即增殖分化能力。对各组hPDLSCs进行成骨诱导,比较各组骨向分化能力,首先使用成骨诱导液对各实验组的hPDLSCs成骨诱导7天后,采用ALP碱性磷酸酶染色法进行染色,通过肉眼观察及Image J软件检测成骨诱导7天时三组hPDLSCs骨向分化的差别;其次对各实验组的hPDLSCs成骨诱导21天后,分别进行茜素红染色,通过肉眼观察及Image J软件检测各实验组矿化结节的数量及矿化结节的染色面积,通过量化数据判断成骨诱导21天时各年龄组hPDLSCs骨向分化能力的变化。使用成脂诱导液对各组hPDLSCs进行成脂诱导14天后再进行油红O染色,通过Image J软件检测染色面积,从而判断成脂诱导14天时各年龄组hPDLSCs成脂分化能力的改变。同时,通过SA-βG染色法对三组hPDLSCs的衰老情况进行检测,比较其衰老情况的差异。最后通过RT-PCR方法对三组hPDLSCs多能性相关的转录因子Nanog及Sox2的表达结果进行检测。结果各组hPDLSCs均表现出良好的增殖能力,常规培养的前四天,三组干细胞增殖率无明显统计学差异,培养至第五天时,增殖能力出现统计学差异,显示hPDLSCs的增殖能力的变化与年龄因素相关,hPDLSCs的增殖能力(增殖率)随着供体年龄的增加而呈下降趋势。对三组hPDLSCs成骨诱导实验显示,无论诱导7天后进行的ALP碱性磷酸酶染色还是诱导21天后进行的茜素红染色,hPDLSCs的骨向分化能力均随供体年龄的增加而下降。对三组hPDLSCs成脂诱导14天后进行的油红O染色显示,hPDLSCs成脂分化能力随供体年龄的增加呈上升趋势。三组hPDLSCs进行的SA-βG衰老染色证实了三个实验组干细胞衰老程度的差异,提示其衰老表达随年龄增加呈显著的上升趋势。实时定量PCR的结果显示,随着供体年龄增加,hPDLSCs对于多能相关转录因子Nanog及Sox2的表达水平也呈下降趋势。结论不同年龄阶段来源hPDLSCs的生物学特性与年龄因素密切相关,其增殖能力(增殖率)及成骨分化能力均随着供体年龄的增加而显著下降,其多能性相关转录因子Nanog及Sox2的表达水平也随年龄增加而下降,但其成脂分化能力随着供体年龄的增加呈上升趋势,SA-β-gal衰老表达也显示随年龄增长的上升趋势。
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