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蛋白质是生命的物质基础。基因通过转录、翻译和翻译后修饰一系列过程才能合成结构复杂完整的蛋白质,进而对其功能的行使有着不可或缺的影响。作为一种重要的翻译后修饰,蛋白质S-酰化修饰（棕榈酰化修饰）通过将棕榈酸或长链饱和脂肪酸共价结合到靶蛋白的半胱氨酸残基上,从而在蛋白质胞内定位、运输、分选、细胞内信号传导等生物过程中发挥着重要作用。蛋白质的S-酰化修饰主要通过DHHC-CRD类棕榈酰基转移酶（DHHC蛋白）催化,研究发现多种蛋白质受S-酰化修饰的调控,但关于其具体机制及信号通路的研究主要源于动物和细菌,植物中的相关研究较为落后。作为世界上最重要的粮食作物之一,水稻中DHHC蛋白的研究甚少,且没有已报道的DHHC-底物。我们实验室前期研究发现水稻中许多DHHC基因的转录受非生物胁迫的影响,但其参与非生物胁迫反应的具体分子机制仍未知。鉴于此,本研究围绕水稻OsDHHC蛋白家族开展了生物信息学分析和生化实验,具体结果如下:（1）构建水稻OsDHHCs文库及利用其筛选OsDHHC-底物。采用系统进化树和序列比对的方式选择并克隆了水稻中5个潜在的S-酰化修饰底物,同时克隆了水稻中OsDHHCs蛋白家族的全部基因从而构建了水稻OsDHHCs文库。通过双分子荧光互补（Bi FC）的实验方法,筛选出了水稻中5对潜在的OsDHHC-底物,分别是OsDHHC30-OsCBL2、OsDHHC30-OsCBL3、OsDHHC13-Os NAC9、OsDHHC14-Os GSD1和OsDHHC18-Os NOA1。（2）验证水稻OsDHHCs文库的效用性。为了进一步证明所构建的水稻OsDHHCs文库筛选出的互作蛋白的可靠性,通过免疫共沉淀（Co-IP）和半体外蛋白结合（Semi-in vitro pull down）实验分析,发现OsDHHC30能与类钙调磷酸酶亚基B蛋白OsCBL2和OsCBL3直接互作,从而证实了用于Bi FC分析的水稻OsDHHCs文库效用性。（3）OsCBL2和OsCBL3是S-酰化修饰的底物。构建了植物表达载体CBL2-Myc和CBL3-Myc,并分别在本氏烟叶片瞬时表达这两个基因编码的融合蛋白,利用酰基-生物素置换法（Acyl-biotinyl exchange,ABE）和酰基PEG交换法（Acyl PEG exchange,APE）两种方法证明了OsCBL2和OsCBL3蛋白能被S-酰化修饰。（4）OsDHHC30蛋白具有S-酰基转移酶活性。利用酵母回补和ABE两种方法证明了OsDHHC30蛋白具有S-酰基转移酶活性。方法一将构建的载体p YESNT-DHHC30转化入S-酰基转移酶缺失的酵母菌株akr1中,通过形态观察发现OsDHHC30能够回补因S-酰基转移酶缺失而造成的细胞表型,从而证明OsDHHC30蛋白具有S-酰基转移酶活性。方法二将构建的载体1300-YFP-DHHC30在本氏烟叶片中瞬时表达,提取蛋白后通过ABE和免疫印记沉淀（Western blotting）的实验方法,证实OsDHHC30蛋白能进行自我S-酰化修饰,从而具有S-酰基转移酶活性。（5）OsDHHC30的亚细胞定位和功能分析。生物信息学预测OsDHHC30有四个跨膜结构域。将构建的YFP融合蛋白表达载体1300-YFP-DHHC30在水稻原生质体中瞬时表达,发现OsDHHC30并未定位在细胞膜上,而进一步质膜组分分离实验证明OsDHHC30定位于生物膜,说明OsDHHC30可能定位于内膜系统。对OsDHHC30基因的启动子进行分析,发现其可能参与氧化胁迫、干旱胁迫等非生物胁迫的响应。为进一步探究OsDHHC30的功能,利用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）分析了该基因在Na Cl、PEG和高温等不同逆境条件的转录模式,结果表明OsDHHC30对不同处理的响应不同,并极有可能参与水稻高温和盐胁迫的信号转导。于是构建了OsDHHC30的过表达载体1300-DHHC30-Flag和1390-YFP-DHHC30和双靶点突变体载体CRISPR/Cas9-DHHC30,通过农杆菌介导的方法分别转入野生型水稻,获得了14个独立的过表达株系和1个杂合的基因敲除突变体株系,用于后续表型验证。综上所述,本文构建了水稻OsDHHCs文库,通过Bi FC实验筛选出了5对水稻中潜在的OsDHHC-底物,并选择了其中的两对OsDHHC30-OsCBL2和OsDHHC30-OsCBL3展开了详细的研究。通过Co-IP和半体外pull down实验证实了他们之间的互作,分别用两种方法证明了OsCBL2和OsCBL3是S-酰化修饰的底物与OsDHHC30具有S-酰基转移酶活性。通过逆境表达模式分析发现OsDHHC30极有可能参与水稻高温和盐胁迫的信号转导,从而构建了OsDHHC30的过表达株系和基因敲除突变体株系,为后续进一步研究OsDHHC30的功能提供指导基础。