【背景】砷（Arsenic）是普遍存在的一种环境污染物,全球范围内有数以亿计的人和动物常年处于砷超标环境中。砷中毒可对人及动物的多种器官系统产生损伤,尤其是雄性生殖系统。为了深入探究砷的生殖毒理机制,本试验采用小鼠睾丸间质细胞系（MLTC-1）作为研究对象,通过建立砷中毒细胞模型,研究自噬相关标志基因与蛋白表达的影响及其调控作用。本试验研究结果将为深入揭示砷的生殖毒理机制,筛选人和动物砷中毒的分子靶标或生物标志物提供理论和实践依据。【方法】对小鼠睾丸间质细胞系（MLTC-1）使用不同浓度As₂O₃进行处理。先通过MTT法来确定As₂O₃处理的最适浓度（3、6、9μM）,后通过Lyso-Tracker Red和MDC荧光染色检测自噬体数量变化;并提取总RNA和总蛋白,通过qPCR和Western Blot方法检测自噬相关基因和蛋白Beclin1,LC3,Atg7和p62的表达水平变化。随后,通过使用抑制剂rapamycin和3-MA分别抑制mTOR和Vps34以及转染siRNA沉默Beclin1,在分别抑制这三种自噬体形成调节因子后对细胞以9μM As₂O₃攻毒处理,24小时后提取总蛋白检测自噬LC3,Atg7和p62等表达水平变化。【结果】1.通过Lyso-Tracker Red和MDC荧光染色发现,不同浓度（0、3、6、9μM）As₂O₃攻毒24小时后,As₂O₃浓度越高,红色和绿色荧光强度越大,说明As₂O₃浓度越高自噬体在细胞内聚集的越多。2.与空白对照组相比,LC3的mRNA表达水平在3μM和6μM As₂O₃处理组中未有变化,在9μM As₂O₃处理组显著上升（P<0.001）;同样,Beclin1和Atg7的mRNA表达水平在3μM和6μM As₂O₃处理组没有变化,在9μM As₂O₃处理组显著上升（P<0.05）;p62的mRNA表达水平在6μM As₂O₃处理组显著上升（P<0.05）,在9μM As₂O₃处理组p62的mRNA表达水平高于对照组但没有统计学差异。3.从蛋白表达水平上看,与空白对照组相比,3μM和6μM As₂O₃处理细胞24小时后,LC3-II/LC3-I比值没有变化,Beclin1,Atg7和p62的蛋白表达水平略有升高但没有统计学差异,LC3-II/LC3-I比值在9μM As₂O₃处理24小时后显著上升（P<0.05）,9μM As₂O₃处理组中Beclin1,Atg7和p62的表达水平也显著上升（P<0.05,P<0.01,P<0.01）。4.As₂O₃对细胞进行攻毒前先经20 nM rapamycin（mTOR抑制剂）预处理1 h,结果显示,mTOR抑制后LC3-II/LC3-I的比值高于对照组但没有统计学差异,Atg7表达水平显著升高（P<0.05）,p62表达水平显著降低（P<0.001）;抑制后再经As₂O₃处理,LC3-II/LC3-I的比值和Atg7、p62表达量均未显示显著变化。结果显示mTOR被抑制后影响了砷暴露导致的自噬相关蛋白的变化,表明mTOR参与了砷诱导自噬体形成时的调控。5.使用RNA干扰技术沉默Beclin1之后,随Beclin1表达的显著降低（P<0.05）,LC3-II/LC3-I比值显著降低（P<0.05）,p62的表达水平显著升高（P<0.05）,Atg7的表达水平没有显著变化;Beclin1沉默后再经砷暴露,Beclin1、Atg7与p62的表达水平与LC3-II/LC3-I的比值没有变化。说明Beclin1在砷诱导的自噬体形成中起调节作用。6.Vps34的mRNA表达水平在9μM As₂O₃处理组中被显著上调（P<0.05）,免疫荧光结果也显示Vps34蛋白表达水平在砷暴露环境下显著上升。Vps34抑制剂3-MA可以显著降低LC3-II/LC3-I的比值（P<0.05）并且显著升高p62的表达水平（P<0.001）,Atg7在Vps34抑制后与对照组相比没有显著变化;Vps34抑制后（5 mM 3-MA预处理1小时）再加入9μM As₂O₃处理24小时LC3-II/LC3-I的比值与Vps34抑制组相比显著上升（P<0.05）但是低于9μM As₂O₃处理组（P<0.05）,p62表达水平与Vps34抑制组相比没有显著变化但是高于砷处理组（P<0.05）。说明砷作用于Vps34调控自噬体的形成。7.对mTOR通路及Beclin1-Vps34复合体中自噬调节基因的mRNA表达水平进行检测发现,mTOR和Atg13的mRNA表达水平在处理组中相比对照组没有显著变化,ULK1的mRNA表达水平在9μM As₂O₃处理组中与对照组相比显著升高（P<0.05）;Vps15的mRNA表达水平未受砷暴露的影响,Atg14和UVRAG的mRNA表达水平在9μM As₂O₃处理组中与对照组相比显著上升（P<0.05,P<0.01）,Rubicon的mRNA表达水平与对照组相比没有显著差异。mTOR通路及Beclin1-Vps34复合体中的自噬调节基因在砷暴露下表达水平发生改变,说明二者参与了砷诱导的自噬体形成。【结论】本次实验结果显示,砷暴露会导致MLTC-1细胞中自噬相关基因与蛋白表达水平的上调,导致自噬体的增多,mTOR通路和Beclin1-Vps34复合体在其中起调节作用。砷暴露导致的自噬体增多一方面是由于砷诱导自噬形成增多,另一方面砷又抑制成熟自噬体的降解。自噬体的过度堆积对机体有毒害作用,这也许是砷生殖毒性的一种体现。