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第一部分 球形螺旋多肽复合物的制备及性能表征[目的]构建具有螺旋结构多肽（DPP）,包载阿霉素（DOX）后与PKM2-siRNA联合形成纳米复合物再用透明质酸（HA）进行表面修饰,对纳米复合物DD-H/P的性能进行表征。[方法]通过化学合成并冻干后得到DPP,利用凝胶渗透色谱法（GPC）测定分子量（MWs）和分散度,并采用圆二色谱（CD）评价多肽在水溶剂中的螺旋构造。将DOX密封进DPP的疏水腔里形成载药复合物DD,与PKM2-siRNA通过静电吸附作用形成纳米复合物DD/P,然后在复合物外表面覆盖一层HA形成最终纳米复合物DD-H/P。通过动态激光散射仪来测量复合物按DPP和siPKM2的不同质量比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1）及 HA 和 DPP 不同质量比（0:4、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1）构成的直径和电动电势,确定最佳比例。用荧光光谱测定法检测纳米复合物DD-H/P包载DOX并计算出载药量（DLC）和载药率（DLE）,用动态激光散射仪和琼脂糖凝胶电泳实验测试纳米复合物在血浆中的稳定性。用荧光光谱测定法检测DD-H/P纳米复合物在不同时间段及不同pH（pH 7.4,6.5,5.0）中药物的释放,通过琼脂糖凝胶电泳实验测试DD-H/P在不同浓度肝素（0.005,0.01,0.05,0.1,0.5 mg/mL）溶剂中siRNA的释放。[结果]GPC分析显示多肽MWs为82400 g/mol,相关聚合度（DP）为276,多分散性指数（PDI）为1.31。DPP水溶剂的CD评价显示在208和222 nm处有两处极小值,证明是稳定的α螺旋结构。动态激光散射仪结果显示当DPP/HA/siPKM2的质量比为20/20/1时得到了粒径最小（127 nm）并且稍带负电动电势（-8.1 mV）的DD-H/P纳米复合物。DD-H/P纳米复合物的DLC和DLE分别为6.1%和75.3%。动态激光散射仪和琼脂糖凝胶电泳实验结果均表明DD-H/P在血清中可保持稳定性。实验显示DD-H/P中siRNA在肝素浓度大于0.1 mg/mL时可释放出来,而且在不同pH下DOX的释放模式具有双相性和pH依赖性。[结论]DDP具有稳定的螺旋结构,DD-H/P纳米复合物有较高的DLC和DLE,在血清中可以保持稳定,并在一定条件下可以释放出siRNA及DOX。第二部分DD-H/P纳米复合物引起的PKM2基因沉默对癌细胞耐药性及凋亡的作用及机制的研究[目的]探讨DD-H/P纳米复合物引起的PKM2基因沉默对癌细胞耐药性及凋亡的作用及机制。[方法]通过流式细胞术来检测DD-H/P纳米复合物将siRNA递送进癌细胞的能力,使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察纳米复合物溶酶体逃逸能力,进而评估DD-H/P纳米复合物的膜活动性。通过real-time PCR技术来检测各种复合物处理过的癌细胞内PKM2 mRNA的表达情况,并利用Western blot技术检测PKM2的蛋白表达情况,评估DD-H/P的基因沉默效果。通过CLSM和流式细胞术检测癌细胞中siPKM2抑制DOX外排从而扭转耐药性的能力。使用ATP检测试剂盒来检测癌细胞内ATP水平,利用CLSM观察线粒体膜电位（ΔΨm）的高低、活性氧自由基（ROS）的含量,通过Western blot技术检测cytochrome C（Cyto C）和caspase 3的蛋白表达,用来研究DD-H/P纳米复合物诱导耐药癌细胞凋亡的作用机制。然后通过MTT实验,死活双染实验,Annexin-V-FITC/PI双染实验对DD-H/P的体外协同抗癌作用进行评估分析。[结果]流式细胞术检测结果显示DD-H/P具有强大的细胞内siRNA递送能力,同时通过CLSM影像观察到癌细胞内的纳米复合物也可以从溶酶体内高效地逃逸出来,证明了球形螺旋多肽具有强大的膜活性。通过real-time PCR技术分析结果显示当DPP/siPKM2质量比为20/1时DD-H/P纳米复合物表现出强大的基因沉默效率,Western blot实验分析得出PKM2蛋白水平的下降也有同样的趋势。ATP检测试剂盒检测出DD-H/P纳米复合物处理过的癌细胞中ATP水平明显下降了 60%,同时利用CLSM观察到癌细胞核中显示出大量DOX的荧光,流式细胞术得出了同样的结果。可以通过CLSM观察到DD-H/P纳米复合物治疗后的癌细胞发出绿色荧光,表明了DD-H/P导致线粒体显著衰竭并凋亡,同时观察到癌细胞内ROS水平明显提高。Western blot检测结果显示DD-H/P纳米复合物提高了癌细胞内的Cyto C和caspase 3在细胞质内的表达水平。MTT实验、死活双染实验、Annexin-V-FITC/PI双染实验的实验结果均可以看出DD-H/P纳米复合物明显降低耐药癌细胞的生存率。[结论]DD-H/P纳米复合物具有强大的膜活性,可以将DOX和siPKM2高效地递送进癌细胞内,通过基因沉默作用抑制ATP产生,阻碍细胞内DOX外排同时产生饥饿效应,还可以诱导线粒体衰竭凋亡,促进癌细胞死亡,最终达到协同抗癌的作用。第三部分DD-H/P纳米复合物对A549/ADR肿瘤抗癌作用的研究[目的]探讨DD-H/P纳米复合物对A549/ADR肿瘤抗癌作用。[方法]将载瘤小鼠分为3组,分别为DOX组,DD/P组和DD-H/P组,通过荧光光谱测定法对DOX,DD/P和DD-H/P复合物进行药代动力学研究,并利用小动物活体成像系统分析各个时间点（1,6,12,24 h）载瘤小鼠体内DOX的分布情况。将载瘤裸鼠分为5组,分别为PBS对照组,DOX组,DD-H/N组,D-H/P组和DD-H/P组,在21天的观察期内每隔3天测量裸鼠的肿瘤体积,观察期结束后收集主要脏器及肿瘤进行切片,利用H＆E染色观察各组脏器的变异及肿瘤组织的凋亡情况,使用TUNEL法进一步观察肿瘤组织的凋亡,使用CLSM和流式细胞术观察肿瘤组织细胞内DOX的蓄积。分别通过real-time PCR和Western blot分析肿瘤组织内PKM2的基因沉默效果及蛋白表达。此外,通过免疫荧光染色观察肿瘤组织内PKM2的分布情况。[结果]与DOX组、DD/P组相比,DD-H/P组拥有一个较长的半衰期（4.21 h）,而且小动物活体成像显示DD-H/P组肿瘤的DOX荧光强度比另外两组都高。在同一观察期内其他组肿瘤的生长没有被抑制,而DD-H/P组肿瘤的生长得到完全抑制。与之相符的是,DD-H/P组小鼠在50天观察期内达到80%的生存率,明显高于其他组小鼠。通过肿瘤组织H＆E染色切片可以观察到,DD-H/P组肿瘤组织显示出更多的细胞核凝结和分裂,表明肿瘤得到控制。肿瘤组织TUNEL染色切片显示DD-H/P组的癌细胞凋亡水平也比其他组显著升高。此外,DD-H/P和D-H/P纳米复合物都能使PKM2 mRNA的表达下调。Western blot和免疫荧光染色分析也都显示出DD-H/P组和D-H/P组中PKM2表达明显降低。CLSM影像显示DD-H/P组的耐药癌细胞内有大量药物蓄积并有更多的DOX递送进入了细胞核,流式细胞术分析也显示出同样的结果。[结论]DD-H/P纳米复合物诱导A549/ADR肿瘤内PKM2表达下调,促进耐药癌细胞的药物蓄积,并导致癌细胞凋亡,最终抑制了肿瘤生长。