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糖尿病下肢血管病变(lower-extremity arterial disease,LEAD)又称糖尿病周围动脉疾病(peripheral arterial disease,PAD),目前研究认为糖尿病下肢血管病变的病理机制与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的形成有关。AS是下肢血管病变与冠状动脉疾病(Coronary Artery Disease,CAD)共同的病理基础。与CAD相似,血脂异常、吸烟、高血压及糖尿病亦是PAD的危险因素。此外,遗传因素在PAD的发生发展中起到重要作用。全基因组关联研究(Genome-wide Association Study,GWAS)发现了多个与疾病发病风险相关的位点,其中有些位点对疾病发病风险具有升高作用,有些位点对疾病发病风险则具有降低作用,其发现的遗传变异研究已经被用来预测CAD及PAD。而染色体9p21上的位点rs1333049不仅与CAD相关,同时与PAD相关,表明冠状动脉疾病及外周动脉疾病可能存在共同的遗传学基础。国内外多项研究发现,rs599839单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与CAD的发生存在显著关联,rs599839及rs646776与急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)发病风险亦显著相关。同时,GWAS还发现,人类染色体1p13上的位点rs599839、rs646776及rs12740374与血清胆固醇(Total Cholesterol,TC)和/或低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)显著相关。rs599839SNP是心肌梗死和LDL-C的风险变异,其机制可能与rs12740374 SNP相关。sortilin 1是定位于高尔基体的细胞内蛋白,介导了包含载脂蛋白B的脂质颗粒的转运过程。rs12740374 T位点使SORT1 m RNA的表达增加,sortilin 1蛋白水平升高,从而降低了血液中VLDL和LDL水平,进而降低冠脉疾病患病风险。而rs12740374 G位点作用与之相反。血糖及糖化血红蛋白水平是反映机体糖代谢状况的重要指标。当血糖调节异常时,可以增加2型糖尿病及大血管疾病的发病风险。GWAS已经确定了与血糖相关的32个位点,其中有些位点与2型糖尿病发病风险亦相关。有学者研究发现,印度锡克教徒染色体1p13上位点rs599839与空腹血糖水平及2型糖尿病发病风险相关,但在中国尚未见报道。综上所述,1p13上的位点与冠状动脉粥样硬化性疾病发病风险及血糖、血脂异常存在一定的相关性,同时这些位点还与CAD及MI患病风险相关。本文将研究1p13上rs599839、rs646776及rs12740374位点SNP与糖尿病下肢动脉粥样硬化性血管病变相关性,并探讨其可能机制,以期更好的理解疾病的病理生理学机制及发现疾病治疗的新靶点。第一部分染色体1p13上位点rs599839、rs646776及rs12740374多态性与糖尿病下肢血管病变的相关性研究目的:探讨染色体1p13上位点rs599839、rs646776、rs12740374与2型糖尿病患者下肢血管病变的相关性。方法:1本研究DM组选取442例2型糖尿病患者,DMPAD组选取440例糖尿病PAD患者,所有研究对象均来自中国汉族人群,无血缘关系。排除甲状腺机能亢进及减退,严重肝肾功能障碍及基因分型失败者。2收集所有受试者的身高、体重、血压、踝肱指数(ABI)、糖化血红蛋白(Hb A1C)、血脂等。提取外周血白细胞基因组DNA,应用Taqman探针技术对3个候选SNPs进行基因分型。3统计学分析采用SPSS 16.0软件,两组人群基因型频率采用Hardy-Weinberg平衡定律检验。计量资料组间比较采用独立样本t检验及秩和检验。用基因计数法计算各组基因型和等位基因频率(构成比),计数资料、各组基因型和等位基因频率之间比较采用卡方检验。单因素及多因素分析采用Logistic回归分析。结果:1 DMPAD组与DM组相比,年龄、病程、吸烟、高血压、Hb A1C、TC、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、LDL-C、体重指数(BMI)、降脂治疗、冠心病及脑梗死患病率差异均有统计学意义(P<0.05),性别、甘油三酯(TG)差异无统计学意义(P>0.05);2 DMPAD组与DM组相比,rs599839 A与G、rs646776 A与G、rs12740374 G与T等位基因频率差异均有统计学意义(P<0.05);在显性模型,rs599839 AA与AG+GG,rs646776 AA与AG+GG,rs12740374 CC与CT+TT基因型频率差异均有统计学意义(P<0.05);在隐性模型,rs599839 AA+AG与GG,rs646776AA+AG与GG,rs12740374 CC+CT与TT基因型频率差异均无统计学意义(P>0.05);3在DMPAD及DM组,rs599839 Hardy-Weinberg平衡检验c2值分别为0.069和0.439,P值分别为0.792和0.507;rs646776Hardy-Weinberg平衡检验c2值分别为0.881和1.393,P值分别为0.347和0.237;rs12740374 Hardy-Weinberg平衡检验c2值分别为0.376和0.340,P值分别为0.539和0.559。3个位点基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05);4单因素logistic回归分析表明,年龄、病程、吸烟、高血压、降脂治疗、Hb A1C、TC、HDL-C、LDL-C、BMI、rs599839、rs646776、rs12740374基因型、冠心病及脑梗死均与糖尿病PAD相关(P<0.05)。多因素logistic回归分析,年龄、Hb A1C、TG、LDL-C、吸烟、高血压、糖尿病病程、冠心病及脑梗死是糖尿病PAD的独立风险因素(P<0.05),而HDL-C、rs599839、rs646776、rs12740374基因型是糖尿病PAD的保护因素(P<0.05)。第二部分1p13上位点rs599839、rs646776及rs12740374多态性与糖脂代谢的关联研究目的:探讨染色体1p13上位点rs599839、rs646776及rs12740374与血糖、血脂的相关性。方法:1研究人群同第一部分。收集所有受试者的身高、体重、血压、ABI、空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,FPG)、餐后血糖(Post-Prandial Glucosese,PPG)、Hb A1C、TC、TG、HDL-C及LDL-C。2提取外周血单个核细胞基因组DNA,应用Taqman探针技术对3个候选SNPs进行基因分型。3统计学分析采用SPSS 16.0软件,正态分布计量资料用均数±标准差表示,非正态分布资料经对数转换成正态资料用均数±标准差表示,计数资料用百分数表示,基因型与各指标相关性采用协方差分析和spearman法进行检验。结果:1校正年龄、性别、吸烟、高血压、降脂治疗后,所有研究人群rs599839、rs646776及rs12740374不同基因型间LDL-C差别均有统计学意义;spearman相关分析表明两者呈负相关(P<0.05),相关系数分别为-0.166、-0.131及-0.146;2所有研究人群校正年龄、性别、吸烟、高血压、降脂治疗后,rs599839、rs646776及rs12740374不同基因型间FPG、PPG、Hb A1c、TC、TG、HDL-C、BMI差别均无统计学意义(P>0.05);3校正年龄、性别、吸烟、高血压、降脂治疗后,DMPAD组rs599839AA与AG+GG、rs646776AA与AG+GG、rs12740374GG与GT+TT基因型相比,LDL-C差别均有统计学意义;spearman相关分析表明两者呈负相关(P<0.05),相关系数分别为-0.172、-0.129及-0.150。4、DMPAD组校正年龄、性别、吸烟、高血压、降脂治疗后,rs599839、rs646776及rs12740374不同基因型间FPG、PPG、Hb A1c、TC、TG、HDL-C、BMI差别均无统计学意义(P>0.05)。第三部分1p13上位点rs599839、rs646776及rs12740374多态性与糖尿病下肢血管病变相关性的机制研究目的:探讨染色体1p13上位点rs599839、rs646776、rs12740374位点基因多态性在糖尿病下肢血管病变发生发展中的作用机制。方法:1分别对第一部分DM组及DMPAD组进行rs599839、rs646776及rs12740374基因型连锁不平衡及单倍体型分析。2考虑到rs599839、rs646776及rs12740374基因型频率,随机选取第一部分DMPAD组中rs599839 AA、rs646776 AA及rs12740374 GG基因型各25例,另选择rs599839AG+GG、rs646776 AG+GG及rs12740374GT+TT基因型各25例,其中每个位点的两个基因型频率比值与总DMPAD人群两基因型频率比值一致,检测所选样本SORT1 m RNA的表达。3应用She SIS软件进行rs599839、rs646776及rs12740374的连锁不平衡及单倍体型分析。统计学分析采用SPSS 16.0软件。不同基因型SORT1 m RNA表达情况比较采用两独立样本t检验,P<0.05差异有统计学意义。结果:1 DM组rs12740374与rs599839,rs12740374与rs646776,rs599839与rs646776之间的连锁不平衡系数D’分别为0.933,0.977,0.930;r2分别为0.689,0.914,0.655。DM组3个位点间均存在连锁不平衡。rs12740374与rs646776之间连锁不平衡程度最强;2 DMPAD组rs12740374与rs599839,rs12740374与rs646776,rs599839与rs646776之间的连锁不平衡系数D’分别为0.915,0.959,0.922;r2分别为0.558,0.849,0.613。DMPAD组3个位点间均存在连锁不平衡。rs12740374与rs646776之间连锁不平衡程度最强;3 rs12740374,rs599839与rs646776单倍体型TGG频率在DM及DMPAD组间差别有统计学意义(P<0.01),OR值及95%CI为0.502(0.297-0.846);4 rs12740374 GT+TT与GG基因型,rs646776 AG+GG与AA基因型,rs599839 AG+GG与AA基因型相比,SORT1 m RNA表达均升高,2-△△Ct值分别为5.81(3.07,11.00),3.94(1.64,9.44),2.36(0.73,7.62),差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:1年龄、Hb A1C、TG、LDL-C、吸烟、高血压、糖尿病病程、冠心病、脑梗死是糖尿病PAD的独立风险因素,而HDL-C是糖尿病下肢血管病变的保护因素。2 1p13上位点rs599839AG+GG、rs646776 AG+GG、rs12740374GT+TT基因型是糖尿病下肢血管病变的保护因素。3在显性模型,总研究人群及糖尿病下肢血管病变人群rs599839、rs646776及rs12740374基因多态性与LDL-C呈负相关关系。4 rs12740374、rs599839与rs646776单倍体型TGG是糖尿病PAD的保护因素。5不同基因型之间SORT1 m RNA的差异性表达揭示了rs599839、rs646776及rs12740374基因多态性与糖尿病PAD之间可能存在的作用机制。