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第Ⅰ部分中文摘要Ⅰ非小细胞肺癌相关的mRNA表达、生物信息学分析和临床意义目的:肺癌是最致命的恶性肿瘤之一,目前仍是我国乃至世界上发生率和死亡率都位居前列的恶性肿瘤,而非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌85%左右[1]。目前多数早期肺癌能得到手术切除。但即使是病理分期为Ⅰ期的肺癌患者,仍有20%到39%的可能性在5年内出现复发,导致预后差[2]。近年来,基因组测序技术的快速发展,加深了人们对肿瘤异质性的认识。目前,较多研究已发现肿瘤分子标志物在癌症诊断、治疗及预后评价中的价值。而目前已知肺癌相关肿瘤分子标志物临床应用价值仍未被证实。本研究的主要目的有:1.筛选在肺癌组织中异常表达的基因,从中寻找对肺癌诊断有较高敏感性和特异性的差异基因;2.寻找可指示肺癌预后的差异基因。肺癌组织标本的研究采用两个阶段设计,在发现阶段（discovery phase）,经过分析数据库中组织mRNAs芯片数据,得到NSCLC相关差异表达mRNAs。对差异mRNAs进行生物信息学分析,并进行GO分析和Pathway分析。利用RRA法对差异mRNAs进行排序,筛选出32个差异基因,其中15个上调基因,17个下调基因。在验证阶段,通过对TCGA数据库中腺癌和鳞癌患者肺癌和癌旁组织样本及临床信息进行收集,进一步验证候选mRNAs差异表达并分析差异mRNAs与临床指标的关系。方法:1.运用 Gene Expression Omnibus（GEO）,ArrayExpress 和 Pubmed database这三个数据库进行文献检索,得到符合纳入标准的研究。收集每篇研究中的mRNAs芯片数据并将差异基因根据上调、下调分为2类。通过R语言运用RRA方法（FDR＜0.05）,得到筛选后的上调和下调基因。2.将筛选的差异基因利用GeneCodis网络工具在线进行GO通路分析和Kegg通路分析。3.通过TCGA数据库（癌症基因组图谱）搜索32个差异基因并进行生物信息学验证。分析32个差异基因mRNA在肺腺癌及癌旁组织、肺鳞癌及癌旁组织中的表达及其临床意义。4.对差异mRNAs进行ROC分析。5.分析差异基因与肺癌分期及淋巴结转移的相关性。6.对差异mRNAs进行K-M生存分析。结果:1.通过检索,有22个已发表的基因表达谱研究符合研究的纳入标准（表1）。通过RRA分析,我们找到643个差异基因,其中315个上调基因,328个下调基因。根据FDR值的大小,结合涉及的研究数目,在315个上调表达的基因选择前15个基因,328个下调表达的基因中选择前17个基因。上述基因均至少在8个基因表达谱研究中有报道（表2）。2.将筛选的315个上调表达的基因和328个下调表达的基因进行GO通路分析和Kegg通路分析。GO通路分析分为生物过程、细胞组分和分子功能三个部分。结果表明,生物过程项主要富集在有丝分裂细胞周期、细胞分裂、细胞周期、有丝分裂、多细胞组织发育等。细胞组分项主要富集在细胞质、胞外区、质膜、胞外间隙、胞质溶胶等;分子功能项主要富集在蛋白结合、ATP结合、钙离子结合、核苷酸结合、同源蛋白结合等。KEGG通路分析表明,这些基因与细胞周期、ECM-受体相互作用、蛋白质消化吸收、局灶粘附和p53信号通路有关。（表3,图1）。3.分析腺癌和癌旁组织的32个差异基因mRNA表达。从TCGA数据库下载腺癌的RNA-seq数据,其中有56对腺癌和癌旁组织,通过独立样本的T检验,这32个基因在肺癌和癌旁组织中的差异表达都有统计学意义（表5）。使用箱图绘制上述基因在肺癌和癌旁组织中的差异,箱图中可见上述基因在肺癌和癌旁组织中均有明显差异（图2）。分析鳞癌和癌旁组织的32个差异基因mRNA表达。从TCGA数据库下载鳞癌的RNA-seq数据,其中有51对鳞癌和癌旁组织。通过独立样本的T检验验证,这32个基因在肺鳞癌和对应的癌旁组织中的差异表达都有统计学意义（表6）。使用箱图绘制上述基因在肺癌和癌旁组织中的差异,箱图中可见上述基因在肺癌和癌旁组织中均有明显差异（图3）。4.32个差异基因的mRNAs表达进行ROC分析。腺癌中,单个mRNA中,AUC面积最大的是PYCR1,AUC为0.996（图4A）。鳞癌中,单个mRNA中,AUC 面积最大的是 TEK、CLIC5、CDH5,AUC 均为 0.999（图 4B）。5.选取TCGA数据库中498份腺癌标本和485份鳞癌标本分析上述基因在肿瘤分期和淋巴结转移中的相关性。我们将标本按照TNM分期分为Ⅲ、Ⅳ期和Ⅰ、Ⅱ期两组。我们利用独立样本的T检验分析这32个基因在肺腺癌和肺鳞癌不同分期中的差异。在肺腺癌中,TOP2A、ANLN、KIAA0101、UBE2T、TPX2、CCNB1、CENPF、FAM107A、CLIC5、AGER、ADAMTS8、TCF21 和LIMS2在Ⅲ、Ⅳ期和Ⅰ、Ⅱ期的对比中差异有统计学意义（表7）;在肺鳞癌中,UBE2T、CENPF、AGER和LIMS2在Ⅲ、Ⅳ期和Ⅰ、Ⅱ期的对比中差异有统计学意义（表8）。我们利用独立样本T检验分析显示SPP1、TOP2A、ANLN、MMP11、KIAA0101、UBE2T、PYCR1、PAFAH1B3、TPX2、CCNB1、CENPF、FHL1、CLIC5、AGER 和 ADAMTS8mRNA 表达水平与肺腺癌淋巴结转移有关（表 9）;TOP2A、ANLN、CENPF、GPM6A、FHL1、FAM107A、CA4、S1PR1、FABP4、CLIC5、ADAMTS8、TCF21、HIGD1B和FCN3mRNA表达水平与肺鳞癌淋巴结转移关系密切（表10）。6.从TCGA下载生存数据,并将生存数据和差异基因表达整合在一起,做接下来的生存分析。剔除资料不完善的标本,选取TCGA中484份腺癌标本和474份鳞癌标本,对上述32个基因进行K-M生存分析并绘制生存曲线。通过分析,我们利用Kaplan-Meier分析从TCGA数据库中构建了一个新的独立队列,其中包括484例肺腺癌组织和474例肺鳞癌组织（OS）,350例肺腺癌组织和324 例肺鳞癌组织（RFS）。结果表明,SPP1、TOP2A、ANLN、KIAA0101、UBE2T、TPX2、CCNB1、CENPF高表达,CA4、AGER低表达的腺癌患者中位生存期更短（表1 1,图5）;SPP1高表达,CA4、CLIC5、AGER、TCF21、HIGD1B、FCN3低表达的鳞癌患者中位生存期更短（表13,图7）。此外,ANLN、KIAAA0101、OCIAD2、UBE2T、PAFAH1B3、TPX2 CCNB1的高表达水平与肺腺癌中较短的RFS密切相关（表12,图6）,而KIAA0101的高表达水平、TCF21的低表达水平与肺鳞癌中较短的RFS相关（表14,图8）。结论:1.32个基因在肺癌和癌旁组织中差异均有显著性;2.32个基因在ROC分析中均有明显差异（P＜0.05）,均有一定的诊断效能。3.TOP2A、ANLN、KIAA0101、UBE2T、TPX2、CCNB1、CENPF 的高表达与肺腺癌的淋巴结转移、临床分期、预后等均明显相关。第Ⅱ部分 中文摘要ⅡCENPF在肺腺癌中的作用及其作用机制目的:在第一部分研究中，结合TCGA数据库中483例腺癌样本的预后数据，对高表达组和低表达组进行Kaplan-Meier生存分析发现，高表达组的SPP1TOP2A、ANLNKIAA0101 UBE2T、TPX2、CCNB1CENPF的生存期显著低于低表达组。在上述基因中，去掉既往文献中已有在肺癌中进行基因功能研究的，剩下TPX2、UBE2T和CENPF尚未在肺腺癌中进行功能研究，我们进一步做了这三个基因的MTT试验，发现CENPF的差异更显著，然后选择 CENPF进行接下来的功能实验。CENPF被发现在多种肿瘤中表达升高，部分肿瘤中还发现它和分期、预后等临床指标相关。我们利用细胞功能学及动物实验验证CENPF在肺腺癌中的作用，并探讨相应的作用机制。方法:1.对TPX2、UBE2T 和CENPF 这三个基因进行MTT试验，筛选出目标基因CENPF。2.利用在线公共数据库调查 CENPF的表达水平，并采用Kaplan-Meier分析评估CENPF与LUAD预后的相关性。3.使用13对匹配的临床LUAD和癌旁组织标本进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。4.通过qRT-PCR检测四株常用肺癌细胞株中CENPF的表达丰度，结合 MTT试验选择A549细胞株进行后续试验。5.分别通过MTT、流式细胞术和集落形成实验研究了CENPF表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和集落形成的影响。6.建立裸鼠右前肢腋窝移植肺癌模型，探讨CENPF对LUAD肿瘤发生的影响。结果:1.通过TPX2、UBE2T和CENPF三个基因的MTT试验，发现CENPF的差异更显著，然后选择CENPF进行接下来的功能实验。2.与相邻非肿瘤肺组织相比，GEPIA分析提示LUAD患者癌组织中CENPFmRNA表达明显升高（P＜0.001）。CENPF上调与LUAD患者的病理分期、无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）显著正相关。3.qRT-PCR结果显示;在13对匹配的LUAD组织和邻近非肿瘤组织中，CENPF在LUAD中高度上调（P=0010），与芯片分析结果一致。4.qRT-PCR结果显示，与小细胞肺癌细胞系（H446和H69）相比，在LUAD细胞系（A549和H1299）中 CENPF表达上调。5.敲减CENPF抑制 A549细胞增殖，引起S期阻滞，促进细胞凋亡，降低LUAD细胞的集落数。6,在裸鼠右前肢腋窝实验异体移植肺癌模型中，敲减CENPF显著抑制了 LUAD细胞的肿瘤生长。结论:1.CENPF的敲减抑制肺癌A549细胞的增殖、侵袭转移，并促进细胞的调亡。2.CENPF在肺腺癌组织中高表达，并与肺腺癌患者的预后相关，从而在肺腺癌的发生发展中发挥重要的调控作用。3.CENPF在LUAD中呈促癌作用，可以作为预后生物标记物和LUAD的潜在治疗靶点。