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背景:爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)是一种人类γ疱疹病毒,感染95%以上的成年人。EBV感染与淋巴细胞源性和上皮细胞源肿瘤的发生密切相关。EBV 相关胃癌(EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC)是胃癌的一个独特类型,占所有GC病例的近10%,但其发病机理仍不清楚。有研究表明,EBV编码的潜伏膜蛋白2A(Latent membrane protein 2A,LMP2A)可通过几条重要通路调节下游基因和miRNA的表达,在EBV相关肿瘤进展中发挥重要作用。LMP2A蛋白可能影响LMP1介导的NF-κB信号传导,从而增加miR-155的转录表达;LMP2A还可以激活PI3K/AKT途径抑制TGF-β1介导的细胞凋亡。同时,LMP2A蛋白N末端具有富含脯氨酸的区域,可以与Nedd4家族泛素蛋白连接酶的WW结构域结合。Smad家族成员2(Smad2)已被确定为TGF-β信号通路下游的关键元件;且Smad2可以作为酵母ATG6同源物(beclin1,BECN1)启动子区域上游的阻遏物抑制自噬的发生。可见,Smad2是具有调节细胞增殖、分化、凋亡以及自噬等多种生物学活性的多功能转录因子。目的:探讨EBV对Smad2转录因子的影响,进一步明确其调控机制以及Smad2在EBVaGC发生发展中的作用。材料和方法:①采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和蛋白质印迹技术分别检测EBV阳性胃癌细胞系(GT39,SNU719,GT38)以及EBV阴性胃癌细胞系(BGC823,SGC7901,HGC27)中Smad2和miR-155-5p的转录表达。②采用CCK-8和流式分析检测miR-155-5p对EBV阳性细胞系增殖、凋亡和周期的影响。③miRNA-155-5p模拟物或抑制剂分别转染SGC7901和GT39细胞后,Western blotting检测Smad2和p-Smad2的表达。④将LMP2A重组表达质粒和对照质粒分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,筛选出稳定表达外源性LMP2A的细胞克隆SGC7901-LMP2A,Western blotting 和 qRT-PCR 检测对Smad2 和 miR-155-5p 转录表达的影响。⑤采用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理SGC7901-LMP2A细胞,Western blotting和qRT-PCR检测Smad2蛋白和miR-155-5p转录表达的变化。⑥PI3K抑制剂 LY294002 处理后 Western blotting 检测 SGC7901-LMP2A 细胞克隆中 Smad2 及相关蛋白的表达。⑦蛋白酶体抑制剂MG132处理后检测SGC7901-LMP2A细胞克隆中Smad2及相关蛋白的表达。⑧在SGC7901细胞系中分别转染50nm siSmad2和阴性对照,采用CCK-8和流式分析检测干扰Smad2蛋白后细胞增殖和凋亡的改变。⑨Western blotting检测干扰Smad2基因表达后,BECN1和LC3B蛋白的表达。结果:①与EBV阴性胃癌细胞比较,EBV阳性胃癌细胞中Smad2蛋白表达水平较低;而与Smad2的表达不同,EBV阳性胃癌细胞系中miR-155-5p的转录表达较高。②CCK-8和流式细胞分析结果表明,与对照组比较,miR-155-5p过表达可降低细胞活力,并提高细胞凋亡率,而miR-155-5p转录表达下调则与之相反。③转染miR-155-5p抑制剂作用GT39细胞后,Smad2蛋白表达上调,明显高于对照组细胞(t=2.897,P<0.05)。与对照组细胞比较,转染miR-155-5p模拟物的SGC7901细胞中Smad2蛋白水平显著降低(t=3.835,P<0.05)。④与对照组细胞比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901-LMP2A细胞中Smad2蛋白表达明显降低(t=5.835,P<0.05),而miR-155-5p的转录表达则明显升高(t=6.874,P<0.05)。⑤与DMSO对照组比较,采用BAY11-7082处理稳定过表达LMP2A的SGC7901-LMP2A细胞克隆后,miR-155-5p 转录表达水平明显降低(2.5μM:t=5.748,P<0.05;36h:t=5.433,P<0.05;48h:t=6.175,P<0.05),但 Smad2 表达水平则明显升高(2.5μM:t=3.764,P<0.05;5μM:t=5.761,P<0.05;10μM:t=4.379,P<0.05)。⑥与对照组比较,采用PI3K抑制剂LY294002处理稳定表达LMP2A的SGC7901-LMP2A细胞克隆后,Smad2和p-Smad2 蛋白表达明显上调(Smad2:30μM:t=6.374,P<0.05;40μM:t=4.853,P<0.05;50μM:t=7.143,P<0.05.p-Smad2:30μM:t=3.786,P<0.05;40μM:t=6.630,P<0.05;50μM:t=3.694,P<0.05)。⑦MG132 处理稳定表达 LMP2A 的 SGC7901-LMP2A 细胞克隆后,Smad2和p-Smad2表达明显高于对照组(Smad2:6h:t=5.383,P<0.05;10h:t=3.693,P<0.05;12h:t=6.725,P<0.05.p-Smad2:6h:t=6.293,P<0.05;10h:t=5.164,P<0.05;12h:t=4.463,P<0.05)。⑧CCK-8和流式细胞分析显示在SGC7901细胞中干扰Smad2表达后细胞活力增强而细胞凋亡率下降。⑨Western blotting显示在SGC7901细胞中干扰Smad2表达后自噬相关基因BECN1和LC3B蛋白表达上调。结论:LMP2A可抑制EBVaGC中转录因子Smad2蛋白表达。①LMP2A可通过NF-κB信号通路上调miR-155-5p的转录表达,进而靶向抑制Smad2及相关蛋白表达。②LMP2A可激活PI3K/AKT通路以抑制Smad2表达,并降低磷酸化Smad2的表达水平。③LMP2A可能调节Smad2泛素化降解。④Smad2和p-Smad2的低表达可阻断TGF-β信号通路进而调节细胞增殖、凋亡以及自噬的发生。