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目的:探讨孤儿核受体NR2E1对胰岛素抵抗小鼠胰岛β细胞代偿性增殖的调控作用,体外实验研究NR2E1对葡萄糖和胰岛素作用下NIT-1细胞增殖的影响,并对其下游靶点进行探讨和验证。方法:Crispr-cas9法构建NR2E1基因敲除鼠,基因型鉴定后,8周龄NR2E1-/-鼠（KO-NR2E1）与对应的同窝WT鼠各24只,随机分为以下四组:（1）NR2E1-/-鼠,标准饮食（standard diet）,标记为 KO-SD 组,n=12;（2）NR2E1-/-鼠,高脂饮食（high-fat diet）,标记为 KO-HFD 组,n=12;（3）WT 鼠,标准饮食（standard diet）,标记为 WT-SD 组,n=12;（4）WT 鼠,高脂饮食（high-fatdiet）,标记为WT-HFD组,n=12。KO-SD组与WT-SD组以标准饲料喂养8周,KO-HFD组与WT-HFD组以高脂饲料喂养8周。观察小鼠体重、摄食、血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数及糖耐量等代谢参数的变化。胰腺标本固定后Ki67与INS免疫荧光双标评价细胞增殖率,INS特异性标记胰岛区域评价胰岛β细胞面积,游离胰岛组织,通过RT-PCR和Western-blot方法检测PTEN及其下游基因表达变化。胰岛β细胞系NIT-1体外培养,使用慢病毒为感染载体,建立稳定上调（OE-NR2E1）的细胞系及同种载体空转对照（OE-Ctrl）,稳定下调NR2E1（KD-NR2E1）表达的细胞系及同种载体对照（KD-Ctrl）,低糖（5mMGlucose）、高糖（20 mM Glucose）、高糖联合胰岛素（20 mM Glucose+100 nM insulin）三种培养条件下,流式细胞术检测细胞周期,Ki67标记阳性率及CCK-8实验评价细胞增殖水平,RT-PCR和Western-blot方法检测PTEN和其下游基因表达变化。生物信息学分析预测NR2E1与PTEN启动子的结合区域,核染色质免疫共沉淀（ChIP）技术验证PTEN是否为NR2E1作用的直接靶点。在KD-NR2E1细胞系中使用PTEN抑制剂VO-Ohpic处理,观察是否可以拯救NR2E1缺陷引起的变化。结果:在标准饮食情况下,KO-SD鼠的血糖、血清空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、糖耐量试验,胰岛β细胞面积,胰岛β细胞增殖率,PTEN及其下游基因的表达等均与WT-SD鼠无差异。高脂饮食可诱导WT和KO鼠糖耐量受损及胰岛素抵抗,相较于WT-HFD鼠,KO-HFD鼠糖耐量受损更严重,空腹血糖升高更明显,而空腹胰岛素则低于WT-HFD鼠,二者在HOMA-IR上无明显差异。高脂饮食对于KO鼠和WT鼠,均可增加胰岛β细胞面积和胰岛β细胞增殖率,但是,KO-HFD鼠的胰岛β细胞面积和胰岛β细胞增殖率明显低于WT-HFD鼠。对PTEN蛋白及mRNA水平,AKT蛋白磷酸化水平,cyclinD2蛋白及mRNA水平进行检测,标准饮食下,WT鼠和KO鼠未表现出明显差异。在高脂饮食诱导下,WT-HFD鼠PTEN蛋白表达下降,从而对AKT活化的抑制作用减弱,cyclin D2表达增加,高脂饮食的KO组中,不仅PTEN明显高于WT-HFD组、AKT磷酸化水平和cyclin D2水平均明显低于WT-HFD组,而且KO-HFD组与KO-SD组在PTEN蛋白,以及AKT磷酸化水平上均无明显差异。相比于KO-SD组,KO-HFD组cyclinD2水平仍可升高,但明显低于WT-HFD组。在5 mM葡萄糖浓度下,下调或者上调NR2E1均不影响NIT-1细胞的G1/S期转变、细胞增殖、PTEN及其下游基因的表达。在KD-Ctrl和OE-Ctrl中,增加葡萄糖浓度以及加入胰岛素,均能促进NIT-1细胞由G0/G1期向S/G2/M期转变,促进细胞增殖。相关蛋白和mRNA表达的结果提示,在KD-Ctrl和OE-Ctrl中,增加葡萄糖浓度以及加入胰岛素,均能抑制NIT-1细胞PTEN蛋白表达,增加AKT活化,增加cyclinD2蛋白表达。而在KD-NR2E1细胞中,葡萄糖和胰岛素对细胞周期的调控作用减弱,葡萄糖和胰岛素对PTEN的抑制作用减弱,从而AKT磷酸化水平较KD-Ctrl组低,下游cyclin D2蛋白水平较KD-Ctrl组低。在OE-NR2E1细胞中,过表达NR2E1可促进葡萄糖和胰岛素诱导的β细胞G1/S期转变,葡萄糖和胰岛素作用下,OE-NR2E1细胞的PTEN蛋白及mRNA水平明显低于OE-Ctrl组,AKT蛋白磷酸化水平、cyclinD2蛋白明显高于OE-Ctrl组。生物信息学方法在PTEN的启动子序列-1756～-1751 bp处预测出可能与NR2E1结合的序列AAGTCA。通过核染色质免疫共沉淀技术,使用NR2E1抗体的实验组可扩增出PCR产物,而IgG抗体的阴性对照组无法扩增产物,证明NR2E1通过结合PTEN启动子抑制其转录的激活。使用PTEN特异性抑制剂VO-Ohpic,发现VO-Ohpic拯救NR2E1缺陷对p-AKT和cyclin D2的抑制作用。结论:NR2E1基因敲除鼠模型证实了 NR2E1缺陷导致胰岛β细胞代偿性增殖障碍,体外实验证实NR2E1可能介导了葡萄糖和胰岛素诱导的NIT-1细胞增殖,PTEN可能是NR2E1在胰岛β细胞中的直接作用靶点。