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赤霉病(Fusarium Head Blight,简称FHB)是一种在全球范围内流行的植物病害,对小麦产量造成了巨大影响。赤霉病也会引起食品安全风险,因为致病的镰刀菌可以合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)及其衍生物3-Ac DON、15-Ac DON等毒素。Tir8是参与镰刀菌毒素合成的关键基因之一。不同类型Tri8蛋白可以催化不同的脱乙酰基位点,从而产生不同类型的DON毒素。比如亚洲镰刀菌株Fa1312编码的Tri8蛋白能够催化中间体3,15-di Ac DON在15位碳原子处脱乙酰基形成3-Ac DON;而禾谷镰刀菌Fg1230的Tri8蛋白则催化该中间体3位碳原子处脱乙酰基形成15-Ac DON。表达纯化Tri8蛋白,分析其结构及催化特征,将有利于其作用机制的阐明,有助于小麦赤霉病及其引起的粮食毒素污染问题的防控。本论文研究包括以下几个方面的工作:(一)建立了Tri8蛋白原核表达纯化体系。通过PCR扩增获得Tri8基因并构建原核表达载体,将其导入大肠杆菌ER2566进行诱导表达。为便于纯化,融合蛋白带有MBP和His-tag标签,利用直链淀粉柱亲和层析纯化获得大量融合蛋白,随后用蛋白酶切除融合标签,并利用Ni-HIS trap亲和层析柱去除标签,最终获得不带亲和标签的Tri8蛋白质。这为后续Tri8体外催化特性研究及结构研究奠定了基础,同时也为其它分泌性脂酶家族蛋白的表达纯化提供了可借鉴的技术方案。(二)获得Tri8基因敲除株系。构建Tri8基因敲除载体,并利用农杆菌转化法将其导入野生型禾谷镰刀菌株Fg PH-1,通过抗性及PCR筛选获得敲除株系。对野生型株系和Tri8敲除株系进行诱导培养,对其毒素类型进行分析。结果显示,野生型菌株的产毒类型为15-Ac DON,而基因敲除株系中15-Ac DON的前体3,15-di Ac DON出现累积。该结果证明了Tri8蛋白功能为催化3,15-di Ac DON脱乙酰化,同时该株系可用于后续3,15-di Ac DON的制备,以及Tri8蛋白体外催化特性的系统研究。(三)获得了同时含有两种Tri8基因的镰刀菌株系,该株系可用于DON毒素的制备。禾谷镰刀菌Fg PH-1的Tri8基因编码产物催化3,15-di Ac DON中间体3位碳原子脱乙酰基形成15-Ac DON,亚洲镰刀菌Fa1312的Tri8蛋白催化15位碳原子脱乙酰基形成3-Ac DON。从Fg PH-1菌株克隆Tri8基因并构建过表达载体,然后利用农杆菌介导的遗传转化将其导入亚洲镰刀菌Fa1312,利用抗性筛选和PCR鉴定最终获得目标株系。利用该株系可以制备DON毒素,避免15-Ac DON和3-Ac DON的干扰。上述研究建立了Tri8蛋白的纯化方法,构建了Tri8基因敲除菌株以及Tri8基因的原核表达体系,为进一步的Tri8蛋白催化机制研究、DON毒素的检测、Tri8蛋白结构与功能研究以及DON毒素的毒理学研究奠定了基础。