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目的:同卵双生子(monozygotic twins,MZT)的鉴别依然是法医学未解难题。本课题组对此进行系列研究,构建了一组包含9个序列37个CpG位点的DNA甲基化检测体系,对120对MZT进行研究,以MZT之间甲基化水平差值大于5%作为阈值,区分MZT个体的能力达到94.20%;以10%为阈值时,区分能力为55.33%。为进一步评价该体系的法医学实际应用价值,本课题对该体系进行灵敏度、稳定性、组织一致性、模拟法医实际检材等研究。方法:采集26对MZT(0~80岁)外周血,验证MZT的检测体系区分MZT个体的效能。采集20名健康成年无关个体不同时期外周血样本,采样间隔3个月,时间跨度9个月,共采样4次,验证时间稳定性。采取3例尸检个体的心脏、肝脏、肾脏、和脑组织样本,评价组织一致性。比较两个亚硫酸氢盐转化试剂盒的转化回收率,设置不同浓度转化后DNA进行灵敏度研究。取3名成年无关个体指尖血制备的血痕、口腔拭子及2根含毛囊的头发,评价检测体系对法医实际检材的应用价值。应用E.Z.N.A Blood DNA Midi kit(OMEGA Bio-Tek)提取血液样本的基因组DNA;应用QIAamp DNA Investigator Kit(Qiagen)试剂盒提取头发、口腔拭子、血卡和组织的基因组DNA。DNA经EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO)和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(Qiagen)进行亚硫酸氢盐转化,以转化后的DNA为模板,扩增LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6九条靶序列,对扩增产物进行焦磷酸测序,获得9条序列37个CpG位点甲基化水平的定量数据。应用Excel、SPSS 24.0软件对实验结果进行统计分析。结果:在研究的132份血液样本中,LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS、IGS5、IGS6序列的平均甲基化水平为61.68%、91.23%、91.45%、76.26%、75.45%、84.05%、80.86%、74.21%、82.52%。26对MZT测试样本的结果表明,在甲基化差异阈值为5%和10%的条件下,九条序列区分MZT的数量分别为22对(84.62%)和10对(38.46%),与前期研究中训练样本结果无统计学差异。时间稳定性结果表明,在20名成年无关个体时间跨度9个月间隔3个月的4个血液样本间,同一个体九条序列的甲基化程度均无明显差异,证实其在相对较短时间内具有稳定性。但比较一对MZT间隔7年的甲基化程度,发现只有基因区三条序列LINE-1,GS1和GS3的DNA甲基化程度未发生明显变化,而基因间区六条序列IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6都表现出随着时间的推移,DNA甲基化水平明显降低。组织一致性检测结果表明,在心、肝、肾和脑4种组织样本,LINE-1、IGS1、IGS5和IGS6序列未表现出DNA甲基化差异,但GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4这五条序列甲基化程度存在明显差异。GS1序列在肝组织的DNA甲基化程度高于其它三种组织,IGS3序列在脑组织的DNA甲基化程度低于其它三种组织,DNA甲基化差值>40%。灵敏度研究结果发现,EZ DNA Methylation-Gold Kit和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit的平均转化回收率分别为74.24%和64.76%;序列LINE-1,GS1,GS3,IGS1和IGS2,在转化后DNA为5 ng时,可以得到可靠的结果,序列IGS3,IGS4,IGS5和IGS6在转化后DNA为10 ng时,可以得到可靠的结果。对法医模拟检材进行研究,发现血痕、口腔拭子和毛发三种检材均可检出九条靶序列的DNA甲基化水平,但GS1、IGS2、IGS4和IGS5这四条序列在三种检材的甲基化程度有明显差异。结论:对焦磷酸测序技术构建的九条序列DNA甲基化检测体系进行法医学应用评估,证实该体系对同卵双生子具有一定的区分能力;九条序列的甲基化在一年时间内具有相对稳定性,基因区序列在7年内也很稳定,但基因间区序列表现出明显差异;GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4五条序列的DNA甲基化具有组织差异性,其余四条序列未表现出明显的组织差异性;对于血痕、口腔拭子和毛发三种常见法医检材,均可获得准确结果,检测的最低浓度在5 ng至10 ng之间变化,具体取决于序列。检测灵敏度可满足常量法医检材,具有一定的法医学应用价值。检测体系鉴别MZT的能力及灵敏度尚需进一步提高。