第一部分利用超分支滚环扩增技术检测miR-21目的：利用超分支滚环扩增（hyper-rolling cycleamplification,HRCA）技术建立一种检测microRNA的方法。方法：1.以miR-21为研究对象，根据miR-21的碱基序列（来源于miRbase）设计特异的逆转录引物及锁式探针。2.建立检测miR-21的支链滚环扩增技术，步骤如下：miR-21逆转录出cDNA的逆转录反应；锁式探针环化的连接反应；对已环化的探针进行扩增反应。3.对超分支滚环扩增反应条件进行优化，包括：锁式探针最适浓度，锁式探针连接时间，扩增反应时间。4.通过对不同浓度的模板及不同的microRNA进行检测来研究本方法的灵敏度和特异性。结果:通过对反应条件进行优化，100nM的锁式探针在Taq DNA连接酶作用下46℃连接30min，Bst DNA聚合酶作用下60℃反应50min，可实现靶序列最大效率的扩增。该方法特异性好，最低检测浓度为10pM。结论:超分支滚环扩增技术灵敏度高、特异性好、无需特殊昂贵仪器且简单易操作，能够应用于microRNA的检测。第二部分滚环扩增技术联合DNA芯片检miR-21目的：将滚环扩增技术与DNA芯片技术结合起来，建立一种检测microRNA的固相检测技术。方法：1.以miR-21为研究对象，根据锁式探针与模板结合的特异性碱基序列外的连接序列设计捕获探针，用于醛基化玻片的包被。2.通过人工合成的用生物素标记的捕获探针的互补探针与捕获探针的杂交反应来验证所设计的捕获探针是否能成功固定在醛基片上，并且检测出捕获探针的浓度为多大时固定效果最佳。3.建立检测miR-21的芯片检测技术，步骤如下：捕获探针的固定，已环化的锁式探针与捕获探针的杂交，扩增反应，生物素标记探针与RCA产物的杂交，亲和素标记的纳米金与生物素标记的产物杂交，显色反应。4.反应条件的优化，包括：捕获探针最适固定浓度，捕获探针最适反应浓度，环化探针与捕获探针最适杂交反应温度，环化探针与捕获探针最适反应时间。5.通过对不同浓度的模板及不同的microRNA进行检测来研究本方法的灵敏度和特异性。结果：人工设计的生物素标记的捕获探针的互补探针与预先设计好的并已经按照一定浓度倍比稀释并准确点样于醛基片上预先设计好的点样点的捕获探针进行杂交反应，各捕获探针固定位点均明显呈现阳性反应并且颜色深浅按照点样浓度梯度呈一致性变化，证明我们所设计的探针准确，并且发现捕获探针的最佳固定浓度为5μM。通过对反应条件的优化发现5μM的捕获探针与环化后的探针49℃杂交反应2h，在phi29DNA聚合酶作用下37℃反应60min，可实现靶序列最大效率的扩增。该方法特异性好，最低检测浓度为100fM。结论：本研究成功建立了一种固相RCA检测microRNA的技术，该方法检测灵敏度高、特异性好、无需特殊昂贵仪器且简单易操作。