鸡白痢沙门菌(Salmonella enterica serovar Pullorum, Salmonella Pullorum),又称雏沙门菌,是鸡白痢(Pullorum disease)的病原,具有高度适应专一宿主的特点,能垂直传播,可引起雏鸡的急性败血症,多侵害3周龄以内幼雏,发病率和死亡率极高;对日龄较大的青年鸡也可致病和致死；成年鸡亦可被感染,常导致母鸡产蛋减少,生殖道畸形,体重下降,也导致孵化率和出雏率明显下降,还可感染火鸡,偶能感染其它禽和鸟类,给许多国家的养禽业带来了巨大的危害,并引起严重的经济损失。目前,免疫接种可作为防控沙门菌病的一种重要手段,相对于传统的灭活疫苗,减毒活疫苗能提供更加高效的保护,且能诱导较高的细胞免疫反应。沙门菌致病岛(Samonella pathogenicity island, SPI)2是位于沙门菌基因组上的一个约40 kb的主要毒力基因簇,其编码的Ⅲ型分泌系统2(type Ⅲ secretion system 2, T3SS2)可以分泌多种功能不同的效应蛋白,这些效应蛋白对沙门菌在宿主细胞内的存活和增殖起着重要作用,为进一步引起全身性的感染提供必要条件。目前,已有30多个沙门菌T3SS2效应蛋白被鉴定,其中很多效应蛋白的功能并不单一,大部分与沙门菌的毒力密切相关,cigR是唯一一个缺失后可引起鼠伤寒沙门菌毒力上升的效应蛋白基因。另外,并非这些效应蛋白均存在于所有血清型的沙门菌中,这意味着有些效应蛋白基因在部分沙门菌中是缺失的,或者有些基因在一些沙门菌中是以假基因的形式存在。目前,关于沙门菌毒力基因的研究已越来越深入,但主要模型还是集中在鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌。鸡白痢沙门菌具有其独特的特征,但对于鸡白痢沙门菌相关的研究还很少,尤其是在T3SS2及其效应蛋白方面。本研究主要基于T3SS2及其效应蛋白CigR探讨了其与鸡白痢沙门菌致病性之间的关系,并初步评估了鸡白痢沙门菌减毒株作为疫苗株防控该病的可行性,为从分子水平上探明鸡白痢沙门菌与鸡体的相互作用关系打下基础,也为进一步研究鸡白痢沙门菌感染与致病机理及找到更好防控该病的方法提供理论依据和实验数据。1.鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株的构建及其生物学特性以鸡白痢沙门菌菌株S06004为研究对象,采用λ-red同源重组系统成功构建了鸡白痢沙门菌S06004株的致病岛2(SPI2,约40 kb)缺失株S06004△SPI2。然后测定了该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和致病性等基本生物学特性,并与野生株进行比较。结果显示,SPI2的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性；与野生株一样,该缺失株均能发酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶,而不能发酵蔗糖、麦芽糖、山梨醇、卫矛醇、侧金花醇、乳糖、丙二酸盐、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氢等；且该缺失株具有良好的遗传稳定性；其对2日龄雏鸡的LD50是野生株的252倍。表明SPI2在鸡白痢沙门菌的致病过程中起着重要作用,SPI2的缺失引起鸡白痢沙门菌毒力的显著下降,这为进一步研究鸡白痢沙门菌SPI2的功能及研发减毒疫苗奠定了基础。2.鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株对雏鸡的免疫保护效力评估分别通过口服和肌肉注射两种免疫途径评价鸡白痢沙门菌致病岛2缺失株S06004ASPI2对2日龄雏鸡的免疫保护效力,其中,口服免疫剂量为2×108CFU/只,肌注免疫剂量为2×107CFU/只。体重变化及临床表现结果显示,两种免疫途径均不影响雏鸡的生长性能,与对照组一样,免疫后雏鸡并未表现出任何临床症状,且该缺失株在雏鸡体内具有一定的定植能力；血清抗体水平测定及外周血淋巴细胞增殖实验结果显示,两种免疫途径均能诱导雏鸡产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答反应；在免疫后第10天,分别用鸡白痢沙门菌菌株S06004和鸡伤寒沙门菌菌株SG9对雏鸡进行攻毒,并观察其临床症状,统计其死亡情况,结果显示,在攻毒早期免疫组鸡出现了暂时的和轻微的厌食、腹泻及精神萎顿等症状,5天左右即可恢复,死亡率和发病率极低,而未免疫攻毒对照组的鸡却呈现高发病率和死亡率,临床症状明显。上述结果表明鸡白痢沙门菌减毒株S06004ASPI2对雏鸡具有良好的保护效力,可以作为理想的疫苗候选株,同时为鸡白痢沙门菌减毒疫苗的进一步研究提供了数据。3.鸡白痢沙门菌致病岛2对T3SS2效应蛋白基因表达的影响经序列分析,在鸡白痢沙门菌菌株S06004染色体上共有20个T3SS2效应蛋白基因,其中sifB、sspH2和steC是以假基因的形式存在。采用实时荧光定量PCR方法,通过相对定量分析(2-△△CT)来比较鸡白痢沙门菌菌株S06004与其SPI2缺失株S06004ASPI2在感染禽巨噬细胞HD11 2.5 h、7.5 h和15h时,这20个T3SS2效应蛋白基因mRNA表达水平与S06004感染该细胞1.5 h时这些基因mRNA表达水平的差异。结果显示,这20个效应蛋白基因包括假基因sifB、sspH2和steC在鸡白痢沙门菌感染过程中均有不同程度的表达；SPI2的缺失对基因cigR、gtgA、slrP、sopD、sseK1、steB和steC的表达并没有显著的影响,对基因pipB2、sifB、sopD2、sseJ、sseL、sspH2和steD的表达在三个时间点均有显著影响,而对基因pipB、steA和sifA的表达只在一个或两个时间点有显著影响；缺失株感染时未检测到基因sseF、sseG和spiC的表达。表明鸡白痢沙门SPI2显著影响一些T3SS2效应蛋白基因的表达,而另一些效应蛋白基因的表达并不受SPI2影响；假基因sifB、sspH2和steC在鸡白痢沙门菌的感染过程中也可进行转录；缺失株感染时基因sseF、sseG和spiC未表达与其位于SPI2上有关。这有助于进一步揭示T3SS2及其效应蛋白在鸡白痢沙门菌感染过程中的致病机制,也为深入研究其功能提供了重要线索。4.鸡白痢沙门菌中T3SS2效应蛋白基因分布研究沙门菌T3SS2效应蛋白基因在不同的沙门菌菌株中存在一定的差异性。本研究采用PCR方法检测了在1962年至2013年间从我国分离的237株鸡白痢沙门菌中25个T3SS2效应蛋白基因的分布特征；同时,通过序列比对分析了这25个基因在18株不同血清型沙门菌中的流行特征,它们的全基因组序列来自GenBank。PCR结果显示,在这237株菌株中,基因cigR、pipB、pipB2、slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseJ、sseL、 steA、steB、steC和steD均存在,gogB和sspHl均缺失,基因gtgA、gtgE、sifA、sifB、sseI、 sseK2和sspH2在这237株菌株中的检出率分别为99.6%、45.2%、98.7%、99.2%、5.9%、15.2%和97.5%；与1962年至1979年间相比,2000年至2013年间gtgE、sseI和sseK2的分布水平显著降低。序列比对分析结果显示,有15个基因(cigR、pipB、pipB2、sifA、sifB、 slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseL、steA、steC和steD)在这18株不同血清型沙门菌菌株中均存在,sifB、sseK1、sspH2和steC在一些菌株中是以假基因的形式存在。结果表明,gtgE、ssel和sseK2在这237株菌株中分布具有一定的年代规律性；大部分被检测基因在鸡白痢沙门菌中具有广泛分布；一些基因在微进化过程中形成了假基因。这为进一步分析相关基因的流行特征提供了重要线索,也为更加深入地研究这些效应蛋白基因的功能及了解相关基因的进化提供了数据。5.鸡白痢沙门菌T3SS2效应蛋白CigR功能的初步解析CigR既是一个由沙门菌致病岛3编码的T3SS2效应蛋白,也是一个膜蛋白。本研究采用λ-red同源重组系统成功构建了鸡白痢沙门菌株S06004的cigR基因缺失株S06004△cigR,初步解析了CigR的基本功能。结果显示,cigR的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但能够增强鸡白痢沙门菌在禽巨噬细胞HD11和鸡体内的增殖和/或存活能力,显著降低鸡白痢沙门菌生物膜形成的能力；该缺失株对2日龄雏鸡的LDso仅是野生株的五分之一；另外,在鸡白痢沙门菌感染HD11过程中,利用实时荧光定量PCR方法检测结果显示,cigR的缺失显著影响CXCLI1、 CXCLI2、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10和iNOS的产生,而对IL-4、IL-18、NF-kB1、TGF-β4和]TNF-α的产生并没有显著影响。表明cigR的缺失引起鸡白痢沙门菌毒力的显著升高,显著降低其生物膜形成的能力,并且CigR能够显著影响一些细胞因子、趋化因子及其它免疫相关因子产生。这为更加深入地研究该蛋白的功能奠定了基础。