子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一;占女性生殖道恶性肿瘤的20～30%。近年来随着人口老龄化、肥胖及激素替代的广泛推广;子宫内膜癌发病率在世界范围内逐年上升并且呈现年轻化趋势。大多数子宫内膜癌能被早期诊断;预后良好。但是;晚期及复发性子宫内膜癌患者预后较差。迄今为止;子宫内膜癌的发生和发展机制仍不清楚。因此;研究子宫内膜癌的分子机制;并开发针对子宫内膜癌的新型靶向治疗药物至关重要。　　肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand;TRAIL）可促进各种肿瘤细胞的凋亡;但不能在正常细胞中诱导细胞凋亡;该机制可能为肿瘤靶向治疗提供新的研究方向。然而;在TRAIL抗肿瘤治疗的临床试验中发现许多恶性肿瘤存在TRAIL耐药;这一发现大大限制了TRAIL在肿瘤治疗中的广泛应用。如何增敏TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡过程是目前的研究热点。　　双香豆素的衍生物（Spindlactone A;SPL-A）是一种转化含酸性卷曲螺旋蛋白3（Transforming acidic coiled-coil 3;TACC3）的新型小分子抑制剂;可选择性抑制卵巢癌细胞中心体微管的成核并诱导有丝分裂停滞。双香豆素已被证明可增强化疗药物对各种肿瘤细胞的促凋亡作用;SPL-A与其结构相似;对TRAIL诱导的凋亡是否有调控作用尚不清楚。　　本研究首先通过流式细胞技术、caspase-3活性测定及DNA片段化分析等多种技术;检测经TRAIL干预的子宫内膜癌细胞株的凋亡情况;研究TRAIL对子宫内膜癌细胞凋亡的诱导作用；然后将SPL-A作用于经TRAIL干预后的子宫内膜癌细胞株、子宫内膜基质细胞株及子宫内膜上皮细胞株;通过上述技术分析各组细胞的凋亡情况;探讨SPL-A对TRAIL诱导的细胞凋亡的影响并进一步分析SPL-A增敏TRAIL诱导的细胞凋亡可能的作用机制。　　第一部分 TRAIL对子宫内膜癌细胞凋亡的影响　　目的：探讨TRAIL对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。　　方法：用TRAIL干预子宫内膜癌细胞株（Ishikawa、HEC-1A、RL-952）、子宫内膜基质细胞株HESCs、子宫内膜上皮细胞株HEECs;MTT法进行细胞活力测定;通过检测各组细胞sub-G1期细胞百分比;caspase-3活性和DNA片段化分析;分析各组细胞的凋亡情况;研究TRAIL对子宫内膜癌细胞、子宫内膜基质细胞及子宫内膜上皮细胞凋亡的影响。　　结果：　　1.TRAIL对子宫内膜癌细胞株Ishikawa活力的影响　　不同剂量TRAIL（0;20;40;80ng/ml）作用于子宫内膜癌细胞株Ishikawa;各组细胞活力分别为：（99.97±0.025）%、（97.53±0.134）%、（94.21±0.639）%、（90.04±1.237）%;各组相比无显著性差异;P>0.05。　　2.TRAIL对子宫内膜癌细胞株Ishikawa凋亡的影响　　TRAIL（40ng/ml）作用于子宫内膜癌细胞株Ishikawa;sub-G1期细胞百分比为（6.81±1.02）%;与对照组（5.23±0.69）%相比;差异无显著性; P>0.05；两组caspase-3活性分别为对照组0.28±0.078、TRAIL组0.37±0.051;两者相比;无显著性差异;P>0.05；两组DNA片段含量分别为：对照组2.73±0.95、TRAIL组3.12±1.04;两者相比;差异无统计学意义;P>0.05。　　3.TRAIL对子宫内膜癌细胞株HEC-1A、RL-952凋亡的影响　　TRAIL （ 40ng/ml ）作用于子宫内膜癌细胞株HEC-1A和RL-952 ; sub-G1期细胞百分比分别为（9.37±0.85）%、（8.07±0.74）%;对照组分别为（7.89±0.96）%、（6.31±0.78）%;差异无统计学意义;P>0.05。　　4.TRAIL对子宫内膜基质细胞株HESCs 和子宫内膜上皮细胞株HEECs凋亡的影响　　TRAIL（40ng/ml）作用于子宫内膜基质细胞株HESCs和子宫内膜上皮细胞株 HEECs ; sub-G1 期细胞百分比分别为（ 5.13±0.84 ）%、（5.01±1.14）%;对照组分别为（4.96±0.95）%、（5.67±0.89）%;差异无统计学意义;P>0.05。　　结论：　　1.TRAIL不能显著降低对子宫内膜癌细胞株Ishikawa的活力。　　2.TRAIL在体外对子宫内膜癌细胞株、正常子宫内膜基质细胞株、子宫内膜上皮细胞株的凋亡均无明显诱导作用。　　第二部分 SPL-A增敏TRAIL诱导的子宫内膜癌细胞凋亡的研究　　目的：探讨SPL-A对TRAIL诱导的子宫内膜癌细胞凋亡的影响。　　方法：以双香豆素为底物;合成其衍生物SPL-A。用SPL-A干预经TRAIL处理后的子宫内膜癌细胞株Ishikawa、HEC-1A、RL-952及正常子宫内膜细胞株HESCs、HEECs;通过检测各组细胞sub-G1期细胞百分比; PARP剪切的表达;caspase-3活性和DNA片段化分析等技术分析各组细胞的凋亡情况;研究SPL-A对TRAIL诱导的子宫内膜癌细胞及子宫内膜基质细胞、子宫内膜上皮细胞凋亡的影响。　　结果：　　1.SPL-A（20μM;40μM）、TRAIL（40ng/ml）分别干预子宫内膜癌细胞Ishikawa及二者联合作用于Ishikawa 24h;各组sub-G1期细胞百分比分别为：对照组（5.12±0.77）%、SPL-A 20μM组（7.31±0.98）%、SPL-A 40μM组（8.23±1.04）%、SPL-A 20μM+TRAIL 40ng/ml组（25.5±2.82）%、SPL-A 40μM+TRAIL 40ng/ml 组（ 39.23±2.67 ）%; TRAIL 40ng/ml 组（7.06±1.01）%;与对照组和SPL-A、TRAIL分别单独干预相比;SPL-A与TRAIL联合干预能够显著增加sub-G1细胞群百分比;P<0.05；并且显著增加PARP cleavage表达。　　2.在对各组细胞sub-G1期细胞百分比及PARP Cleavage表达的检测中发现; SPL-A 40μM+TRAIL 40ng/ml 组 sub-G1 期细胞百分比最高（39.23±2.67）%;差异有显著性;P<0.05。　　3.SPL-A（40μM）、TRAIL（40ng/ml）分别干预子宫内膜癌细胞Ishikawa及二者联合作用于Ishikawa 24h ;各组caspase-3活性分别为：对照组0.32±0.089、SPL-A 组0.38±0.081、SPL-A+TRAIL组0.97± 0.092、TRAIL组0.42±0.058;与对照组和SPL-A组、TRAIL组相比;SPL-A+TRAIL组caspase-3活性显著增强;差异有统计学意义;P<0.05；各组DNA片段含量分别为：对照组2.46±0.73、SPL-A 组3.43±0.96、SPL-A+TRAIL组11.39±1.11、TRAIL组3.18±1.02;与对照组和SPL-A组、TRAIL组相比; SPL-A+TRAIL组细胞的DNA片段化显著增强;差异有统计学意义; P<0.05。　　4.SPL-A（40μM）、TRAIL（40ng/ml）分别单独和联合干预子宫内膜基质细胞株HESCs、子宫内膜上皮细胞株HEECs 24h;各组sub-G1期细　　胞百分比分别为：对照组（ 5.19±0.93 ）%/（ 5.82±0.93 ）%、SPL-A组（6.27±0.79）%/（6.31±0.83）%、SPL-A+TRAIL组（8.11± 1.01）%/（6.58± 0.89）%、TRAIL组（5.32±0.87）%/（5.13± 1.09）%;各组差异无显著性; P>0.05。　　5.SPL-A（40μM）、TRAIL（40ng/ml）分别单独和联合干预对子宫内膜癌细胞株HEC-1A、RL-952 24h;各组sub-G1期细胞百分比分别为：对照组（6.47±0.82）%/（5.88±0.65）%、SPL-A组（8.82±0.59）%/（9.12± 0.76）%、SPL-A+TRAIL组（35.94±1.94）%/（38.24± 1.88）%、TRAIL组（8.88±0.83）/（10.06±0.88）%;与对照组和SPL-A组、TRAIL组相比;SPL-A与TRAIL联合干预能够显著增加HEC-1A、RL-952细胞sub-G1期细胞百分比;P<0.05。　　结论：　　1.SPL-A能够增敏TRAIL诱导的子宫内膜癌细胞凋亡;而对正常子宫内膜细胞凋亡无诱导作用。　　2.SPL-A对TRAIL诱导的子宫内膜癌细胞凋亡的增敏作用呈剂量依赖性。　　第三部分 SPL-A对子宫内膜癌细胞抗凋亡蛋白及NQO1表达的影响　　目的：通过检测各组细胞中一系列抗凋亡蛋白c-FLIP;Bcl-2;Bcl-xL; Mcl-1 cIAP1和XIAP的表达水平;研究SPL-A增敏TRAIL诱导的细胞凋亡的可能机制;并通过比较各组细胞活性氧ROS产生及NQO1活性推测其在SPL-A增敏TRAIL诱导的细胞凋亡中的作用。　　方法：将 SPL-A 作用于经 TRAIL 预处理的子宫内膜癌细胞株Ishikawa;及分别转染Bcl-2;Mcl-1;c-FLIP的子宫内膜癌细胞株Ishikawa;实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞Bcl-2 mRNA表达；采用Western blot技术检测各组细胞抗凋亡蛋白c-FLIP;Bcl-2;Bcl-xL;Mcl-1;cIAP1和XIAP的表达水平；荧光显微镜观察各组细胞活性氧（ROS）产生；酶标仪测定NQO1活性;探讨SPL-A增敏TRAIL诱导的子宫内膜癌细胞凋亡的可能途径。　　结果：　　1.SPL-A对子宫内膜癌细胞株Ishikawa抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、c-FLIP、cIAP1及XIAP表达的影响　　SPL-A可下调Ishikawa 细胞中Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、c-FLIP 的表达;且呈剂量依赖性;随SPL-A剂量增加;对Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、c-FLIP表达的抑制作用逐渐增强;差异有统计学意义;P<0.05;但不影响cIAP1、XIAP 的表达;P>0.05；　　不同剂量SPL-A（0;10μM;20μM;40μM）干预子宫内膜癌细胞株Ishikawa 24h;各组细胞Bcl-2 mRNA相对表达量分别为：1.01±0.021、0.68±0.042、0.44±0.023、0.19±0.009;两两比较均有统计学差异;P<0.05；　　相同剂量SPL-A（40μM）不同时间（0;6h;12h;24h）干预Ishikawa;各组细胞Bcl-2 mRNA表达量分别为：1.01±0.002、0.76±0.013、0.33±0.024、0.19±0.009;两两比较均有统计学差异;P<0.05；　　不同剂量SPL-A（0;20μM;40μM）干预转染Bcl-2启动子荧光素酶报告基因的Ishikawa细胞;各组细胞Bcl-2启动子的活性分别为：1.0±0.041、0.73±0.038、0.46±0.022;两两比较;差异有统计学意义;P<0.05。　　2.SPL-A对子宫内膜癌细胞株Ishikawa抑癌基因p53表达的影响：不同剂量SPL-A（0;10μM;20μM;40μM）干预子宫内膜癌细胞株Ishikawa 24h;p53的表达逐渐增加；加入PFT-α（p53抑制剂）后;SPL-A对Bcl-2的抑制作用减弱。　　3.SPL-A（40μM）、TRAIL（40ng/ml）分别作用及二者联合作用于子宫内膜癌细胞株Ishikawa 24h;各组sub-G1期细胞百分比分别为：对照组（5.12±0.77）%;SPL-A组（8.23±1.04）%;SPL-A+TRAIL组（39.23± 2.67）%;TRAIL组（7.06±1.01）%;其中;SPL-A+TRAIL组sub-G1期细胞百分比最高;差异有统计学意义;P<0.05；　　分别转染Bcl-2、Mcl-1、c-FLIP质粒后;SPL-A增强TRAIL诱导的细胞凋亡的作用显著下降;sub-G1期细胞百分比分别为（11.13±0.56）%、（12.93±0.98）%、（19.25±2.06）%;但仍高于SPL-A组和TRAIL组;差异有统计学意义;P<0.05；　　4.SPL-A与ROS的相关性　　SPL-A (40uM)干预子宫内膜癌细胞株Ishikawa 2h; ROS产量显著增加；加入抗氧化剂（NAC或Trolox）后;SPL-A联合TRAIL干预子宫内膜癌细胞株Ishikawa 24h;sub-G1细胞百分比分别为（16.25±1.19）%、（19.06±1.13）%;较未加抗氧化剂组（43.75±2.25）%显著下降;差异有统计学意义;P<0.05；　　5.SPL-A与NQO-1的相关性　　与对照组相比;SPL-A与ES936（NQO-1抑制剂）均能显著抑制NQO-1的活性;对照组1.01±0.031;SPL-A组0.34±0.037;ES936组0.39±0.051;差异有统计学意义;P<0.05；加入ES936（NQO-1抑制剂）;TRAIL作用于子宫内膜癌细胞株Ishikawa 24h;sub-G1细胞百分比（40.03±1.47）%;显著高于对照组（8.73±0.66）%; P<0.05。　　结论：　　1.SPL-A通过上调P53的表达抑制抗凋亡分子Bcl-2的活性。　　2.SPL-A通过下调Bcl-2家族成员Mcl-1和c-FLIP使子宫内膜癌细胞对TRAIL介导的细胞凋亡敏感。　　3.SPL-A对TRAIL诱导的细胞凋亡的作用依赖于细胞中ROS的产生及对NQO1活性的抑制。　　结论：　　1.TRAIL在体外对子宫内膜癌细胞株及正常子宫内膜细胞株的凋亡均无明显诱导作用;提示子宫内膜癌细胞中可能存在TRAIL抵抗。　　2.SPL-A和TRAIL的联合治疗显著诱导各种人类子宫内膜癌细胞的凋亡;但对正常人子宫内膜基质细胞和子宫内膜上皮细胞凋亡无影响; SPL-A作为TRAIL的增敏剂有望为子宫内膜癌的辅助治疗带来新的前景。　　3.SPL-A通过调节凋亡相关蛋白和抑制NQO1活性增加子宫内膜癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。