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T4 DNA连接酶是一种负责DNA连接的关键工具酶,分子量为55.23 k Da的单链多肽（Gen Bank序列号:X00039.1）,催化双链DNA上相邻的3’羟基和5’磷酸末端形成磷酸二酯键。传统的重组T4 DNA连接酶的蛋白纯化方法包括上清液获取、PEI沉淀、硫酸铵沉淀、分子筛层析、DE-52柱层析、镍柱法等方法。但是操作程序繁杂、成本高,纯化体量小等问题,不适合工业大规模生产。随着蛋白纯化技术的发展,多种纯化手段的结合成为可试探性的研究方向。本文采用镍柱和离子柱结合,两步法进行纯化。结果表明,通过采用镍柱和离子柱结合的方法进行纯化,可以实现大规模的纯化生产,获得的T4 DNA连接酶纯度高,活性稳定。本文旨在探讨T4 DNA连接酶的大规模发酵和纯化条件优化,并应用于工业化生产。本文采用分子克隆的方法获得T4 DNA连接酶基因片段,并构建重组表达质粒p ET15b-T4及高产稳定的重组工程菌,菌株命名为BL21（DE3）-15b-T4。对高表达菌株建立了菌种库,并进行稳定性探究。实验结果显示,该重组菌具有典型的大肠杆菌的形态和生理学特性,经过测序和蛋白胶检测,目的基因没有发生突变,且经过1年保存期,菌种的稳定性和表达量满足生产的需要。本研究对获得的重组菌进行了摇瓶发酵培养条件的确定、50 L发酵罐发酵工艺的探索和优化以及蛋白纯化工艺的探究和优化。重组菌的摇瓶发酵工艺为在1%接种量时,IPTG终浓度为0.5 m M、诱导温度为25℃,诱导12 h时,目的蛋白的表达量最高,为后续发酵罐的发酵工艺提供参考。在此基础上,使用50 L发酵罐对发酵工艺条件进一步优化,经过优化后的发酵工艺条件,50 L发酵罐可以获得3 kg菌体,经过初步检测,含有10 mg粗蛋白/g菌。具体的发酵工艺条件为:最佳接种时间和接种量:一级种子培养时间10～12 h二级种子培养时间3～4 h。接种OD 2.5-3.5,最佳接种量4%。最佳培养基配方:葡萄糖10 g/L,蛋白胨3.2 g/L,酵母粉1.8 g/L,三水磷酸氢二钾11 g/L,磷酸二氢钾3 g/L,柠檬酸铵4 g/L,七水硫酸镁1.2 g/L。最佳比生长速率:诱导前比生长速率控制在0.2-0.3 h-1,诱导后比生长速率控制在0.07 h-1。最佳诱导条件:诱导剂浓度IPTG 0.5 m M,诱导OD600为20,诱导温度为25℃。发酵终点:诱导12 h,菌体浓度不再增长则可放罐处理。用300L发酵罐进行发酵工艺放大,成功实现发酵小试工艺的放大生产,各项指标均与50 L罐水平一致,批次产菌量可达15 kg,产量提升5倍。另外,在现有纯化条件的基础上进行纯化工艺的中试放大,产量提升10倍。重复三批次,均通过QC质检。根据线性放大的原则对层析过程进行放大,成品质量保持稳定,生产效率得到大幅提升。结果显示,在优化后的纯化条件下进行了T4 DNA连接酶的纯化中试,每批次得到了2 g左右的T4 DNA连接酶样品。其纯度可达到95%以上,并且经T4 DNA连接酶酶活检测标准进行酶活检测,大规模纯化获得的T4 DNA连接酶酶活为500 U/μL,满足储存条件,并且批次间稳定性良好。本文成功构建了一株可用于工业化大规模生产T4 DNA连接酶的重组菌BL21（DE3）-15b-T4,并对发酵罐的发酵工艺和放大纯化工艺进行了探索和优化,最终得到了较高的菌体表达量和稳定的T4 DNA连接酶,实现了工业化生产及应用。