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研究背景:甲型流感病毒(InfluenzaA virus,IAV)因其传染性强、变异速度快、发病率和死亡率高的特点,已经成为严重威胁人类健康和社会安定的病毒之一。目前接种疫苗是预防流感病毒感染的主要手段,但疫苗的更新速度以及流感病毒不断突变的特点致使常规的季节性疫苗不能有效防治病毒。因此抗流感病毒药物的使用在防治病毒中起到至关重要的作用。迄今为止,临床上使用的抗流感药物主要分为两大类:M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂。但是临床上已出现多种对这上述两种类药物耐药的流感病毒株,使现有抗流感病毒药物的发展应用受到一定影响。因此人们迫切想要寻找到不同于现有作用机制的新型抗流感药物。流感病毒PB2cap结构域基因序列具有高度保守性,已成为抗病毒药物研究的重要靶标之一。然而一个全新的药物从研发到进入临床是一个耗时耗力的过程,因此,对目前已存在且已知安全性的药物进行抗病毒活性研究则可以明显缩短研究周期,如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂类(cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKI)化合物,已发现不同选择性的CDKI对不同病毒,如人类免疫缺陷病毒、疱疹病毒或流感病毒等具有较强的抑制作用。在前期实验中,我们从实体小分子化合物出发,进行基于细胞水平的抗病毒活性筛选,发现Roscovitine是一个极具潜力的抗甲型流感病毒小分子化合物。而Roscovitine作为一种广谱CDKI,已处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段,在用于癌症的治疗中表现出较高的安全性,被认为是治疗癌症,神经退行性疾病,以及病毒感染等潜在的药物。研究目的:本文通过研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂Roscovitine抗甲型流感病毒的活性,探寻其作用机制,期望能够从现有化合物中找到新的抗流感病毒药物,为抗流感病毒药物的研究开发提供新的思路和策略。研究方法:1.使用MTT法测定Roscovitine对细胞活性的影响,MTT结合空斑实验测定Roscovitine对不同亚型的流感病毒的抑制作用以及对子代病毒载量的影响。2.使用蛋白印迹法、免疫荧光和实时荧光定量测定Roscovitine对甲型流感病毒在细胞内复制的影响。3.通过血凝抑制实验、H5N1假病毒抑制实验、神经氨酸酶抑制实验探究Roscovitine对病毒进入或子代病毒粒子释放是否具有抑制作用;time-of-addition实验和mini-replicon实验研究Roscovitine作用于病毒复制的具体阶段。4.通过荧光偏振实验、表面等离子体共振技术和分子对接技术确定Roscovitine的作用靶点。实验结果:1.Roscovitine可抑制多种亚型的甲型流感病毒感染,对A/WSN/1933(H1N1)、A/Aichi/2/68(H3N2)和 A/FM1/47(H1N1)的 IC50分别是 3.35±0.39,7.01±1.84 和5.99±1.89 μM,同时Roscovitine对MDCK和Beas-2B细胞具有较低的细胞毒性,且其抗病毒作用不具有细胞特异性。2.Roscovitine不能抑制病毒引起的血凝现象和H5N1假病毒感染,同时对神经氨酸酶的活性无明显抑制作用。3.Roscovitine在病毒感染细胞后的2-5 h和5-8 h能够明显的抑制流感病毒蛋白和mRNA的表达。4.Roscovitine可显著降低病毒RNA聚合酶的活性,主要通过与PB2cap蛋白特异性结合。5.Roscovitine 能够与 PB2cap 蛋白上的 His-357,Phe-404,Phe-323,Met-431和Lys-376 结合。6.Roscovitine可以下调被病毒激活的JAK/STAT炎症信号通路的表达。实验结论:1.Roscovitine具有抗甲型流感病毒的活性,可抑制不同亚型的甲型流感病毒。2.Roscovitine不作用于病毒的进入和子代病毒的释放过程。3.Roscovitine通过抑制病毒基因组的转录和复制阶段而发挥抗病毒的作用。4.Roscovitine通过与PB2cap蛋白特异性结合抑制病毒的转录和复制。5.Roscovitine下调病毒所激活的JAK/STAT信号通路,抑制炎症过度反应。