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目的:1.建立分离培养脐带基质干细胞(umbilical cord matrix stem cells , UC-MSCs)的方法,了解其生物学特性及分化潜能。2.探讨体外微环境对UC-MSCs向生殖细胞分化的影响。3.观察UC-MSCs移植后在小鼠早衰卵巢中的分布及生长,探讨体内微环境对UC-MSCs分化的影响。方法:1.无菌条件下取正常足月顺产新生儿的脐带,用Ⅰ型胶原酶消化,分离单个核细胞,DMEM培养,获得贴壁细胞,监测细胞生长曲线、流式细胞仪检测其免疫表型。采用不同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成肌方向分化2.采用两种方法对UC-MSCs进行诱导分化,观察体外微环境对UC-MSCs分化的影响。①类胚体诱导:将UC-MSCs进行悬滴培养,使其形成类胚体(embryonic body,EB),进而采用将EB与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养、卵泡液条件培养基培养等方法,体外诱导UC-MSCs向早期生殖细胞分化。通过RT-PCR方法检测特异性基因的表达,流式细胞术和免疫组化检测其免疫表型,观察是否有生殖系特异性标记物的出现。②单层细胞诱导:采用卵泡液作为条件培养基,体外诱导UC-MSCs向生殖细胞分化。3.通过60COγ射线照射处理建立卵巢早衰(Premature ovarian failure , POF)动物模型,慢病毒介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein ,GFP)转染UC-MSCs,经尾静脉移植于POF小鼠体内。在不同时间点取材,通过共聚焦显微镜和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization ,FISH)方法检测移植细胞在小鼠体内的分布和生长情况;通过计数非闭锁始基卵泡数目和测定雌激素水平等方法观察卵巢的损伤修复情况。结果:1.分离的脐带单个核细胞培养后呈纺锤体样,体外增殖达10代以上,P3代细胞中80以上处于G0/ G1期,约20%的细胞处于S + G2 +M期。其分子免疫表型为:CD44、CD73、CD90、CD105阳性,CD31、CD34、CD45、HLA-DR阴性,与骨髓间充质干细胞的免疫表型相似。在不同的诱导条件下,UC-MSCs可向成脂、成骨、成肌方向分化。2.诱导分化培养结果①将UC-MSCs进行悬滴培养,其能够形成EB。②RT-PCR结果发现: EB形成后5天表达生殖系标记物Oct-4、Ifitm-3、stella、vasa、DAZL,作为对照的UC-MSCs仅表达Oct-4、Ifitm-3、stella。③流式细胞术检测结果:EB形成5天后,其中SSEA-1阳性细胞占15.61%。④免疫组化检测结果:形成后5天的EB与人或小鼠的卵巢颗粒细胞共培养,10天后生殖系标记物stella、vasa、SCP3、GDF-9阳性表达,而颗粒细胞及采用卵泡液培养的EB均无表达。⑤单层细胞培养诱导:UC-MSCs用含5%卵泡液培养基诱导20天后,细胞卷曲形成类组织样团块,团块周边不断有悬浮细胞生成并随之脱落,但未检测到生殖系特异性标记物的表达。3.①60COγ射线处理后病理切片提示:小鼠短期内即出现卵巢储备下降、卵泡闭锁、卵巢萎缩等POF样病变,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道、大脑、骨髓等组织未见明显病理损伤,说明模型构建成功。②慢病毒介导GFP转染UC-MSCs的效率达80%以上;UC-MSCs经尾静脉移植后,在受损小鼠卵巢中可发现大量GFP阳性细胞存活并生长,但在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道、大脑、骨髓等组织中均未发现GFP阳性细胞存在。③卵泡计数和雌激素水平均提示干细胞移植组小鼠卵巢损伤修复情况比对照组小鼠修复情况好。结论:1.人UC-MSCs可在体外培养、扩增,细胞免疫表型与BM-MSCs相似,具有成脂、成骨、成肌等多向分化潜能,是一种理想的成体干细胞来源。2.UC-MSC体外悬滴培养可形成EB,与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养后均表达生殖系特异性标记物,提示体外微环境对UC-MSCs向生殖细胞方向分化发挥十分重要的作用,初步表明UC-MSCs具有向早期生殖细胞分化的潜能。3.UC-MSCs移植后能够迁移至功能早衰卵巢并存活生长,卵泡计数和E2水平提示UC-MSCs可能具有卵巢损伤修复作用,表明体内微环境对UC-MSCs的的分化也发挥重要作用。