目的:恶性肿瘤是当今全球死亡率最高的疾病之一。尽管通过放疗、化疗和根治性手术可以获得颇为有效的医治,但辐射抗性是肿瘤复发并影响肿瘤疗效的重要因素,其中肿瘤干细胞是肿瘤放化疗后复发的根源。研究发现维生素D可以通过多种途径抑制肿瘤的进展,同时维生素D还可以有效地抑制肿瘤干细胞的特性。课题组前期研究结果也表明维生素D可以增强小鼠卵巢癌细胞辐射敏感性。为了进一步探究维生素D增强肿瘤辐射敏感性的可能机制,本课题选择男性发病率及死亡率最高的肺癌细胞及女性病死率最高的卵巢癌细胞为研究对象,采用流式细胞术分选肿瘤干细胞作为实验的模型。通过体内外实验探究活性维生素D对肿瘤细胞和肿瘤干细胞辐射敏感性的作用,为肿瘤放射治疗提供基础数据。方法:本研究可以分为两个部分。一、1α,25(OH)2D3增强肿瘤细胞辐射敏感性及其可能的机制:(1)体外实验:100 nM 1α,25(OH)2D3预处理A549和SKOV-3细胞48小时后,在0、1、2、4和6Gy等不同剂量X射线照射后,选择平板克隆实验、悬浮球形成实验及限制性稀释实验分别检测肿瘤细胞的存活率、自我更新能力以及体外致瘤能力,评价活性维生素D对肿瘤细胞辐射敏感性的作用；使用流式细胞仪检测A549细胞凋亡和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的变化;活性维生素D主要通过与其受体(Vitamin D Receptor,VDR)结合调控靶基因发挥作用,故本研究采用特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的慢病毒转染以减少VDR表达,使用平板克隆检测其增强辐射敏感性的作用是否仍存在;同时,检测敲除VDR后其凋亡及ROS的变化,以阐述活性维生素D增强肿瘤细胞辐射敏感性的机制;使用流式细胞术检测细胞中线粒体的损伤,利用ROS抑制剂NAC以及NADPH酶抑制剂DPI和Apocynin,分析ROS产生的场所;通过Real-time qPCR及Western blot检测活性维生素D对NADPH氧化酶的激活以明确活性维生素D肿瘤辐射增敏机制。(2)体内实验:本实验给裸鼠皮下注射2×107个含萤光素酶报告基因的OVCAR8卵巢癌细胞,制作皮下移植瘤模型,维生素D处理组每周肌肉注射1000 IU维生素D3,对照组注射同体积的茶油。每周检测萤光素酶强度以分析肿瘤大小。3周后使用15Gy的X射线局部照射肿瘤部位,继续观察至两月左右进行处死,收集肿瘤组织和血清,进行常规病理学检查和血清25(OH)D水平测定;根据肿瘤体积大小分析维生素D3对肿瘤的辐射增敏作用。二、1α,25(OH)2D3增强肿瘤干细胞辐射敏感性及其可能的机制:使用流式细胞仪分选CD44/CD117双阳性的卵巢癌干细胞,100 nM 1α,25(OH)2D3预处理卵巢癌干细胞48小时后,在0、1、2、4、8和10 Gy等不同剂量X射线照射后,使用悬浮球形成实验和限制性稀释实验分别检测肿瘤干细胞自我更新能力和体外致瘤能力,分析活性维生素D是否可以提高肿瘤干细胞辐射敏感性;Real-time qPCR及Western blot检测活性维生素D处理后肿瘤干细胞中相关通路蛋白及干细胞分化相关蛋白的表达情况,探索其潜在的机制。结果:1.1a,25(OH)2D3增强肿瘤细胞辐射敏感性及其机制研究:平板克隆实验发现,与单独的X射线组进行比较，1α,25(OH)2D3预处理后的A549及SKOV3细胞存活率显著减少(p<0.05),存活曲线下移;悬浮球形成实验结果显示,与单独X射线组相比，1α,25(OH)2D3与X射线联合处理组的悬浮球形成率明显降低;限制性稀释实验也发现,联合处理组能有效降低肿瘤细胞的体外致瘤能力。以上结果提示,活性维生素D可以显著提高肺癌和卵巢癌细胞对X射线的辐射敏感性;凋亡实验发现,1 α,25(OH)2D3和4 Gy X射线单独处理均能使肿瘤细胞发生凋亡。与单独X射线照射组相比,两者联合处理明显增强肿瘤细胞凋亡。ROS检测结果也表明1α,25(OH)2D3及4 Gy X射线单独处理均能促进肿瘤细胞ROS的产生。而与单独X射线照射组相比,联合处理组可以明显增强肿瘤细胞ROS的水平。上述实验结果表明活性维生素D通过促进ROS及凋亡,进而增强肿瘤细胞辐射敏感性。接着,本研究选择ROS清除剂NAC来抑制1 α,25(OH)2D3产生的ROS。流式结果发现,1α,25(OH)2D3促进凋亡的效应基本消失,进一步说明1α,25(OH)2D3通过促进ROS产生、诱导凋亡途径来增强肿瘤细胞辐射敏感性。当X射线照射VDR敲除的SKOV3细胞,平板克隆的结果显示1α,25(OH)2D3并不能减少细胞存活率,提示活性维生素D提高卵巢癌细胞辐射敏感性依赖于VDR;同时流式检测结果也表明,当X射线照射VDR敲除的A549细胞时，1α,25(OH)2D3促进ROS产生和诱导细胞凋亡的效应基本消失,再次证明活性维生素D提高肺癌细胞辐射敏感性依赖于VDR。线粒体和NADPH氧化酶是细胞内ROS产生的主要来源。为了探究1 α,25(OH)2D3促进肿瘤细胞产生ROS的来源,作者检测了 1α,25(OH)2D3处理后线粒体受ROS导致的损伤情况,发现1α,25(OH)2D3可以引起线粒体膜通透性增加,线粒体损伤增加。但是,采用DPI和Apocynin特异性抑制NADPH氧化酶活性后,1 α,25(OH)2D3促进ROS产生的作用消失,并且其引起的线粒体损伤效应也基本消失。说明1α,25(OH)2D3不是通过线粒体途经,而是通过激活NAPDH氧化酶促进肿瘤细胞产生ROS,增加的ROS可以进一步损伤线粒体。本部分采用Real-time qPCR及Western blot实验在VDR正常表达及敲除的A549细胞中检测NADPH氧化酶相关组件,如NOX2、NOX4、p22phox、p47Phox和p67phox的表达。实验结果发现,在VDR表达正常的NC组A549细胞中，1α,25(OH)2D3可以显著升高NOX4、p22Phox和p47Phox的mRNA表达水平;而在VDR敲除的A549细胞中上述效应基本消失。同样地,在蛋白水平，1α,25(OH)2D3可以显著提高p22phox和p47phox的蛋白表达量;而在VDR敲除的A549细胞中上述效应也基本消失。以上结果进一步证明1α,25(OH)2D3通过与VDR结合激活NADPH氧化酶。体外实验结果表明，1α,25(OH)2D3通过与其受体VDR结合激活NADPH氧化酶活性,促进ROS产生,引起线粒体损伤,诱导凋亡,进而增强肿瘤细胞辐射敏感性。为了验证体外实验结果即1α,25(OH)2D3增强肿瘤细胞辐射敏感性,本研究也开展了体内实验。致瘤模型的实验结果显示,与对照组相比,维生素D3组小鼠肿瘤的体积显著下降,小鼠存活时间延长1周左右,血清25(OH)D水平明显升高,表明维生素D3处理可以抑制肿瘤的生长;荷瘤鼠局部放射治疗的实验结果显示,与单独辐照组相比,联合处理组的小鼠肿瘤体积显著下降,小鼠存活时间延长1周左右,其血清25(OH)D水平也有升高的趋势,提示维生素D3能够增强裸鼠肿瘤的辐射敏感性。体内实验结果进一步说明,维生素D3能够增强裸鼠皮下肿瘤的辐射敏感性。综合以上结果表明1α,25(OH)2D3通过与其受体VDR结合激活NADPH氧化酶活性,促进ROS产生,引起线粒体损伤,诱导凋亡,进而增强肿瘤细胞辐射敏感性。2.1α,25(OH)2D3增强肿瘤干细胞辐射敏感性及其可能的机制:本部分采用流式细胞术分选CD44+/CD117+的肿瘤干细胞。悬浮球形成实验结果显示,与单独的X射线照射组相比较，1α,25(OH)2D3预处理的卵巢癌干细胞存活率明显减少,存活曲线显著下移;限制性稀释实验发现,联合处理组能有效降低肿瘤细胞的体外致瘤能力。以上结果表明,活性维生素D可以增强卵巢癌干细胞对X射线的辐射敏感性。有文献报道VDR能与RUNX2及SMAD3结合,所以作者通过Real-time qPCR检测了 RUNX2、SMAD3、YAP和TAZ的表达。实验发现,与未处理对照组相比较，1α,25(OH)2D3处理可以减少SMAD3、YAP和TAZ等mRNA的表达。不仅如此,与4 Gy照射组相比,联合处理组SMAD3的mRNA水平显著上升,而TAZ的表达水平下降。Western blot的实验结果显示,与未处理对照组相比较,1α,25(OH)2D3处理可以减少SMAD3、p-SMAD3、YAP和TAZ等蛋白的表达。同时,与4 Gy照射组相比,联合处理组的SMAD3、p-SMAD3、β-catenin和非磷酸化的β-catenin的蛋白表达水平显著下降,表明1 α,25(OH)2D3可能通过抑制SMAD3和β-catenin的表达来增强肿瘤干细胞辐射敏感性。肿瘤干细胞辐射抗性的原因与其高度未分化状态也有十分密切的关系。有报道1α,25(OH)2D3可以促进肿瘤干细胞分化,为了探讨1α,25(OH)2D3促进肿瘤干细胞的辐射敏感性是否与其诱导分化有关,本部分检测了三个分化相关基因,即上皮细胞表达的标志物E-CAD和EpCAM,紧密连接相关与肿瘤侵袭相关标志物OCCLUDIN。Real-time qPCR实验结果发现1α,25(OH)2D3促进了上皮标志物E-CAD和EpCAM的表达,提示101,25(OH)2D3促进肿瘤干细胞分化。同时,本研究也发现与4 Gy照射组相比,联合处理组的E-CAD和EpCAM也显著增强,提示1α,25(OH)2D3可能通过促进肿瘤干细胞分化增强其辐射敏感性。Western blot结果表明,与4 Gy照射组相比,联合处理组的EpCAM的蛋白水平显著增强,进一步证明1α,25(OH)2D3可能通过促进肿瘤干细胞分化增强其辐射敏感性。第二部分的实验结果表明，1α,25(OH)2D3可能通过抑制SMAD3和β-catenin的表达及促进肿瘤干细胞分化增强其辐射敏感性。结论1.1α,25(OH)2D3通过与其受体VDR结合激活NADPH氧化酶活性,促进ROS产生,诱导线粒体损伤及细胞凋亡增强肿瘤细胞辐射敏感性;体内实验证实维生素D3可以增加移植瘤小鼠的辐射敏感性。2.1α,25(OH)2D3通过诱导分化和抑制SMAD3及β-catenin表达提高肿瘤干细胞的辐射敏感性。