目的：　　 Polo样激酶(Polo-likekinases,Plks)是一类高度保守的丝/苏氨酸激酶,不仅参与调节多种重要的细胞活动,如细胞周期中心体的成熟、纺锤体的形成以及染色体的分离等过程,而且作为癌细胞信号转导网络的枢纽,在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中起重要作用[1]。以往的研究结果提示我们Plk2在肿瘤发生中的作用依赖于细胞的类型和背景或表观遗传学修饰,在不同的肿瘤中扮演不同的角色。研究表明Plk2-/-鼠在胚胎发育过程中延迟骨骼发育和生长,提示Plk2在骨的胚胎发生中起重要的作用[14]。最近,本课题组的研究发现Plk2在骨肉瘤组织中高表达,并且与骨肉瘤的临床分期密切相关,结果提示Plk2可能是参与骨肉瘤发生发展过程中重要基因。　　 核心组蛋白的修饰在改变染色质结构和基因转录方面起到重要的作用。两类酶参与调节蛋白质乙酰化水平,即组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferascs,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histonedcacetylascs,HDACs)。HATs和HDACs在调控蛋白质乙酰化上起到不同的作用,二者的相互作用将会获得蛋白的不同乙酰化水平。HATs和HDACs不仅调节组蛋白的乙酰化水平,而且也作用在转录因子上从而调节基因转录。HATs和HDACs通过被招募到特定启动子区而作用到其中的转录因子而发挥作用。由于蛋白质乙酰化在染色质中的重要作用,所以HATs和HDACs在调控细胞命运和肿瘤形成中起到重要的作用。曲古抑菌素A(TSA)是一种HDAC特异性的抑制剂,能够通过抑制HDAC及招募HAT,使组蛋白和转录相关因子乙酰化,从而改变蛋白质的多种生物学特性,参与基因表达调控。其中转录因子GATA-1就是一个重要的可受乙酰化修饰的转录因子家族成员之一。　　 迄今为止,尚无有关蛋白质乙酰化参与Plk2基因表达调控的报道,同时也没有关Plk2在骨肉瘤细胞中表达和调控的研究。本研究以TSA为乙酰化作用因素,探讨了乙酰化对人骨肉瘤细胞MG-63中Plk2基因表达的调控作用,证明了TSA引起的GATA-1乙酰化对Plk2启动子活性的影响是乙酰化调节Plk2表达的一种机制,为骨肉瘤的治疗提供新的治疗靶点。　　 方法：　　 一、骨肉瘤中Plk2的表达及TSA对骨肉瘤细胞MG-63中Plk2基因表达影响　　 1、利用免疫组化方法检测Plk2在骨肉瘤组织中的表达。　　 2、结合临床资料统计分析Plk2的表达与骨肉瘤病程的关系　　 3、Real-timeRT-PCR检测TSA刺激前后Plk2mRNA表达水平的变化。　　 4、Wcsternblot检测TSA刺激前后Plk2蛋白表达水平的变化。　　 二、骨肉瘤细胞中Plk2基因启动子区GATA-1反应元件的鉴定及GATA-1乙酰化在Plk2转录激活中的作用　　 1、应用软件分析Plk2启动子结构;并构建系列截短的Plk2启动子荧光素酶报告基因载体,利用双荧光素酶检测系统分析TSA刺激前后各段启动子的活性。　　 2、RT-PCR实验检测GATA-1mRNA在MG-63细胞及骨肉瘤组织中的表达。　　 3、ChIP实验在体内条件下验证GATA-1与Plk2启动子上该位点的结合及TSA对这种结合的作用。　　 4、EMSA实验进一步在体外条件下验证GATA-1与Plk2启动子上该位点的结合及TSA对这种结合的作用。　　 5、免疫沉淀结合Westernblot检测TSA对GATA-1蛋白乙酰化水平的影响。　　 6、双荧光素酶报告基因检测系统鉴定GATA-1反应元件在TSA对Plk2启动子活性调节中的作用。　　 结果：　　 一、骨肉瘤中Plk2的表达及TSA对骨肉瘤细胞MG-63中Plk2基因表达影响　　 1、免疫组化结果显示与骨软骨瘤相比,Plk2在骨肉瘤组织中高表达。　　 2、结合临床资料分析Plk2的表达与骨肉瘤的临床分期密切相关。　　 3、Real-timePCR结果显示TSA以浓度依赖方式上调Plk2mRNA表达水平。　　 4、Westernblot结果表明TSA诱导的乙酰化使MG-63细胞中Plk2蛋白表达增加。　　 二、骨肉瘤细胞中Plk2基因启动子区GATA-1反应元件的鉴定及GATA-1乙酰化在Plk2转录激活中的作用　　 1、生物信息学软件分析及荧光素酶报告基因检测在Plk2启动子内发现了一些潜在的受乙酰化调控的转录因子结合位点。　　 2、RT-PCR的结果提示GATA-1在骨肉瘤细胞MG-63及骨肉瘤组织中有明显的表达。　　 3、ChIP实验证实在体内条件下Plk2启动子-1198～-1002和-999～-782区为GATA-1反应元件结合区,并且TSA使GATA-1蛋白与该位点结合增强。　　 4、EMSA实验进一步证明Plk2启动子上-1051区和-949区为GATA-1反应元件,并且TSA使GATA-1蛋白与两个位点结合能力增强。　　 5、免疫沉淀结合Westernblot实验显示TSA可直接引起GATA-1蛋白的乙酰化。　　 6、应用荧光素酶报告基因系统证明了本实验中所鉴定的两个GATA-1反应元件是Plk2启动子中的强大的正调控元件,同时它在TSA引起的Plk2启动子的转录激活中发挥重要作用。　　 结论：　　 1、与骨软骨瘤相比,Plk2在骨肉瘤组织中高表达,并且与骨肉瘤的临床分期密切相关。　　 2、Plk2启动子的-1051和-949区是两个GATA-1的结合位点。　　 3、在骨肉瘤MG-63细胞中,TSA引起GATA-1乙酰化可增加其与Plk2基因启动子区GATA-1反应元件的结合,从而引起Plk2启动子活性的上调,这是乙酰化调节Plk2基因表达的一种机制。