枳壳甘草汤对前脊髓综合征运动功能影响的实验研究

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目的:采用在McBride经典模型制备方法的基础上,利用杠杆原理制备大鼠T13前脊髓综合征模型。评价我院龚老(龚正丰教授是全国名老中医,全国师承制导师之一,按照“大成汤”的配伍原则,结合其数十年临床遣方用药经验)拟方“枳壳甘草汤”对损伤节段脊髓组织中SOD、MDA的表达以及血清中6-酮前列环素(6-Keto-PGF1α)和血栓素B2(TXB2)含量的影响,探讨“枳壳甘草汤”优化组方前脊髓综合征模型的治疗疗效及发生机制。方法:1.取108只雄性SD大鼠,适应环境三天,96只在McBride经典模型制备方法的基础上,利用杠杆原理制备大鼠T13前脊髓综合征模型。随机分为8组(n=12),即模型组、阳性药(甲基强的松龙)组、中药组方(1、2、3、4、5、6)组;余12只为假手术组(操作与造模法相同,但勿用持针器咬去T13椎弓根、横突)。分组后开始给药,中药组方各组灌胃均以10ml/kg体积灌胃1.0g生药/ml的设计均匀枳壳甘草汤的配比方,即剂量为10g生药/kg,阳性药组以10ml/kg体积腹腔注射9mg/ml甲基强的松龙,即剂量为90mg/kg,模型及假手术组灌胃同体积的新鲜蒸馏水,连续给药14天,每天1次。于造模后3h,1、3、7、14d的时间点分别采用BBB(Basso, Beattie, Bresnahan,BBB)评分、CBS (comblna behavior score, CBS)评分方法,对各组试验动物进行运动、神经功能评分。2.取60只雄性SD大鼠,适应环境三天,45只参考文献在McBride经典模型制备方法的基础上,利用杠杆原理制备大鼠T13前脊髓综合征模型。造模后60min后(动物全部苏醒),随机分为3组(n=15),即模型组、阳性药(甲基强的松龙)组、中药优化组方组;余15只为假手术组(操作与造模法相同,但勿用持针器咬去T13椎弓根、横突)。分组后开始给药,中药各组灌胃均以10ml/kg体积灌胃1.0g生药/ml的中药优化组方,即剂量为10g生药/kg,阳性药组以10ml/kg体积腹腔注射9mg/ml甲基强的松龙,即剂量为90mg/kg,模型及假手术组灌胃同体积的新鲜蒸馏水,连续给药28天,每天1次。术后3、14、28d不同时点采用BBB评分表对试验动物进行运动功能评分;术后3、14、28d各组取5只大鼠,相同时点取同节段脊髓组织,一半采用HE等染色技术对切片进行病理观察;一半以比色法检测SOD及氧自由基降解主要产物MDA含量;相同时点取大鼠血清,以酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆6-酮前列环素(6-Keto-PGF1α)及血栓素B2(TXB2)的浓度。结果:1.前脊髓综合征模型组(即各治疗组)动物的BBB评分均随时间的延长逐渐升高,其中阳性药(甲基强的松龙)组和中药组方4治疗组在每个观察点上升的幅度均较其它治疗组大。在造模后第3、7、14d,阳性药治疗组、中药组方4治疗组大鼠的BBB评分均较模型对照组明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05);在造模后第7、14d,中药组方2、3治疗组评分也显著高于模型对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。但是2组BBB评分均值均低于中药组方4治疗组。提示中药组方4治疗组治疗效果优于其它各中药组方治疗组。前脊髓综合征模型组(即各治疗组)动物的CBS评分均随时间的延长逐渐降低,其中阳性药组和中药组方4治疗组在每个观察点下降的幅度较其它治疗组大。在造模后第7、14d,阳性药(甲基强的松龙)治疗组、中药组方4治疗组大鼠的CBS评分均较模型对照组明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05);在造模后第14d,中药组方2治疗组评分也显著高于模型对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。但是其CBS评分均值均低于中药组方4治疗组。提示中药组方4治疗组治疗效果优于其它各中药组方治疗组。2.在造模后第3、14、28d,阳性药治疗组、中药组方4治疗组大鼠的BBB评分均较模型对照组明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。提示中药组方4对脊髓损伤引起的运动功能损伤的保护效应重复稳定至治疗28天,进一步说明能促进脊髓损伤的修复。枳壳甘草汤优化方从造模后3、14、28d脊髓病理组织学观察脊髓形态变化,灰质部神经细胞数量变化,神经细胞形态学改变,脊髓空洞,胶质疤痕形成等各方面评判结果比相同时间点的模型对照组来说均有不同程度的减轻和好转。模型组与假手术组比较:造模后3、14、28d损伤脊髓组织SOD含量降低,MDA含量升高,且有显著性差异(P<0.05)。阳性药组与模型组比较:造模后3、14d损伤脊髓组织SOD含量升高,且有显著性差异(P<0.05),造模后28d损伤脊髓组织SOD含量降升高,无显著性差异(P>0.05);造模后3、14、28d损伤脊髓组织MDA含量降低,无显著性差异(P>0.05)。中药组与模型组比较:造模后3d损伤脊髓组织SOD含量降升高,无显著性差异(P>0.05),造模后14、28d损伤脊髓组织SOD含量降升高,且有显著性差异(P<0.05);造模后3、14、28d损伤脊髓组织MDA含量降低,无显著性差异(P>0.05)。由此提示,枳壳甘草汤优化方组损伤脊髓组织SOD含量随着药物介入时间的延迟而逐步增高,而MDA含量随着药物介入时间的延迟而逐步降低,其中枳壳甘草汤优化方组14、28d介入时间点对SOD含量增高较同时段模型组作用比较明显。造模后3、14、28d,与同时段假手术对照组相比,模型组6-Keto-PGF1α水平显著降低,TXB2水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性药与模型组相比较:造模后3、14、28d6-Keto-PGF1水平升高,其中造模后14d6-Keto-PGF1α水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);造模后3、14、28d TXB2水平降低,其中造模后14d TXB2水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。中药组与模型组相比较:造模后3、14、28d6-Keto-PGF1α水平升高,其中造模后14d6-Keto-PGF1α水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);造模后3、14、28d TXB2水平降低,其中造模后14、28d TXB2水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。由此提示,枳壳甘草汤优化方组前脊髓损伤综合症大鼠血浆中6-Keto-PGF1。药物介入3、14、28d时间点均增高,其中14d介入时间点对6-Keto-PGF1α含量增高较同时段模型组作用比较明显。而大鼠血浆中TXB2含量随着药物介入时间的延迟而逐步降低,其中14、28d介入时间点对TXB2含量增高较同时段模型组作用比较明显。结论:1.枳壳甘草汤优化方(中药组方4:枳壳20g;甘草5g;当归25g;莪术10g;大黄30g;芒硝15g)对脊髓损伤引起的运动、神经功能损伤有保护效应,能促进脊髓损伤的修复。可以作为实际药效最佳剂量配比进行枳壳甘草汤的可能机理的研究。2.枳壳甘草汤优化方治疗有效改善脊髓病理组织学病变;一方面可以提高脊髓损伤大鼠损伤脊髓组织SOD含量,降低损伤脊髓组织MDA含量;另一方面降低脊髓损伤大鼠血浆中TXB2水平,升高6-Keto-PGF1α水平,表明枳壳甘草汤优化方对血管内皮组织具有保护和修复作用,且能有效恢复前列环素酶合成功能,从而使TXB2和6-Keto-PGF1α达到平衡,从而降低急性脊髓损伤后的继发性损伤,增强脊髓组织的修复,保护损伤的脊髓组织,这可能是枳壳甘草汤优化方对脊髓损伤具有保护作用的机制之一二。并且枳壳甘草汤优化方对于前脊髓综合征继发性脊髓损伤的持续治疗效果较为明显。
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