论文部分内容阅读
猪嗜血支原体(Mycoplasma suis,M.suis),是引起猪附红细胞体病(Porcine Eperythrozoonosis,PE)的病原微生物,自发现以来已给养猪业造成了巨大的经济损失。无机焦磷酸酶(Inorganic Pyrophosphatases,PPases)是一种能够催化无机焦磷酸酯(PPi)水解成无机焦磷酸盐(Pi)的重要水解酶,是存在于M.suis中的一种功能性蛋白酶。PPase表现较好的免疫原性,可作为M.suis的一种抗原运用于抗体制备和病原检测试验中。本实验运用原核表达技术体外制备猪嗜血支原体无机焦磷酸酶蛋白(M.suis ppa)并对其进行纯化和鉴定。试验采用PCR方法扩增M.suis的ppa基因,将扩增产物连接至pEasy克隆载体,并将重组载体转入大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)DH5a中进行克隆,并对克隆产物进行PCR产物鉴定和基因序列测定,将测序正确的ppa基因连接至 pET-48b(+)表达载体,并转入E.coli BL21(DE3),IPTG 诱导E.coliBL21(DE3)表达出可溶性ppa融合蛋白;应用镍(Ni2+)柱亲和层析法纯化ppa融合蛋白,并对其进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定。结果表明:(1)实验成功构建了重组克隆质粒pEasy-ppa,测序结果与NCBI数据库一致,目的基因ppa全长495 bp,编码165个氨基酸;(2)实验成功构建了重组表达质粒pET-48b-ppa,并转化入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,最佳诱导表达条件为:IPTG终浓度1.0mmol/L、最佳诱导温度30℃、最佳诱导时间18h;(3)经SDS-PAGE、WesternBlot鉴定,采用Ni2+柱亲和层析法在40 mmol/L咪唑洗杂液和500 mmol/L咪唑洗脱液中检测到纯度较高的ppa融合蛋白,其大小为25 kDa。全文结论:实验成功获得高纯度的可溶性ppa融合蛋白,为后续建立有效的猪嗜血支原体快速检测ELISA方法提供了条件。