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道地药材是指经过中医临床长期应用优选出来的,在特定地域,通过特定生产过程所产的,较在其他地区所产的同种药材品质佳、疗效好,具有较高知名度的药材。内生真菌是指整个生活史或者生活史的一部分存在于植物组织内部,而未对植物健康造成明显伤害的一类真菌。内生真菌普遍存在于健康植物组织中,种类繁多、分布广泛,且具有合成大量药用活性物质的巨大潜力。为了研究牡丹内生真菌与其丹皮道地性是否存在相关性,本试验选取道地丹皮的安徽凤丹牡丹植株,非道地丹皮的洛阳凤丹和著名观赏牡丹品种洛阳红植株种群为研究对象,首先对安徽凤丹丹皮的道地性进行验证,然后从三种牡丹植株中分离、鉴定内生真菌,并对内生真菌种群做多样性分析,从中筛选出能够产生丹皮酚的内生真菌,并对各个牡丹品种内生真菌的PKS,NRPS基因进行筛选,试验结果如下: (1)采用高效液相色谱质谱联用方法(HPLC-MS)对安徽凤丹,洛阳凤丹,洛阳红牡丹三种牡丹的丹皮中的丹皮酚进行鉴定,同时采用色谱法对其丹皮酚含量进行测定。质谱结果显示在保留时间31.87 min左右时,三种牡丹丹皮提取液与丹皮酚标准品出峰时间一致,离子碎片信息一致;在选定的色谱条件下,丹皮酚的线性方程为Y=-388882+3.12948×106X,且在0.1μg/mL~20μg/mL浓度下具有良好的线性关系,丹皮酚含量测定结果显示安徽凤丹丹皮中丹皮酚的含量为24.51?0.83 mg/g,洛阳红牡丹丹皮中丹皮酚含量为14.29?0.76 mg/g,洛阳凤丹丹皮中丹皮酚含量为8.76?0.46 mg/g,t检验法对三组之间的差异性检验结果显示安徽凤丹丹皮中丹皮酚的含量显著大于洛阳红牡丹丹皮和洛阳凤丹丹皮中丹皮酚的含量。 (2)试验采用表面消毒法对安徽凤丹,洛阳凤丹,洛阳红三种牡丹的内生真菌进行分离,从3种牡丹植株中分别分离出了60、98、206株内生真菌。用分子生物学方法对牡丹内生真菌进行分类鉴定,结果显示三种牡丹的内生真菌分属于17、9、10个不同的种属,优势菌种属分别是Phomopsis(拟茎点霉属)、Fusarium(镰孢菌属)、Alternaria(链格孢属)。安徽凤丹内生真菌在数量和种类上与其余两种牡丹的内生真菌差异较大,且香农多样性指数、辛普森多样性指数以及均匀度均优于其他两种牡丹内生真菌,在相似性方面,三种牡丹的内生真菌两两之间相似性并没有显著差异。 (3)试验采用甲醇对内生真菌的新鲜菌丝进行索氏提取,提取液经薄层色谱检测,筛选产丹皮酚的牡丹内生真菌。对初筛阳性结果用气质联用仪进行进一步鉴定。结果从157株内生真菌中共筛选出16株产丹皮酚的牡丹内生真菌,分属于Alternaria(链格孢属),Fusarium(镰孢菌属),Phoma(茎点霉属),Botryosphaeria(葡萄座腔菌属),Paraconiothyrium(拟盾壳霉属),Chaetomium(毛壳菌属), Talaromyces(踝节菌属),Phyllosticta(叶点霉属),Schizophyllum(裂褶菌属)共9个种属,其中Fusarium(镰孢菌属)7株,Paraconiothyrium2(拟盾壳霉属)株,其余种属各1株,Fusarium(镰孢菌属)是产丹皮酚的优势菌种。从安徽凤丹中分离出的内生真菌占4株,从洛阳凤丹中分离出的内生真菌占12株,洛阳红牡丹内生真菌中没有筛选到能够产生丹皮酚的内生真菌。 (4)试验从三种牡丹的内生真菌群体中筛选出了含有 PKS和 NRPS基因片段的内生真菌,对所测得的序列进行了BLASTX比对,并统计了PKS和NRPS基因筛选阳性率。结果显示安徽凤丹中分离的内生真菌PKS阳性率48.15%大于洛阳凤丹(41.07%)和洛阳红(44.59%),NRPS阳性率11.11%大于洛阳凤丹(7.14%)和洛阳红(1.35%)。 结论:内生真菌广泛分布于牡丹植株中,不同品种、不同地区的牡丹内生真菌种群结构和多样性方面差异明显,安徽凤丹内生真菌在多样性方面高于其他品种;牡丹内生真菌具有合成丹皮药用活性成分?丹皮酚的能力,从分离的情况来看,产丹皮酚的内生真菌集中分布于凤丹品种;不同品种的牡丹内生真菌合成次生代谢物的潜力有差别,安徽凤丹内生真菌在PKS、NRPS基因分布方面均高于其他两个牡丹品种。以上研究结果提示牡丹内生真菌与其丹皮道地性成因方面存在相关性。