【目的】 大量的研究证实，多不饱和脂肪酸对维系和调节细胞的正常生物学功能起重要的作用。在多不饱和脂肪酸的生物合成中，脂肪酸去饱和酶起着关键的催化和调控作用。本课题拟从富含多不饱和脂肪酸的海洋微藻中，运用RACE-PCR方法快速、简便的筛选和克隆脂肪酸去饱和酶基因，为进一步探讨多不饱和脂肪酸的生物合成，脂肪酸去饱和酶的功能、机制及应用奠定基础。 【方法】 1.采用GC-MS技术分析6 种海洋微藻的脂肪酸含量和脂肪酸组成。 2.运用3′RACE方法，利用Oligo(dT)和基因特异性引物克隆与脂肪酸去饱和酶基因具有一定同源性的候选基因片段。 3.运用5′RACE方法，利用克隆并测序的3′末端的候选基因片段设计引物克隆5′端序列。 4.运用Overlap-PCR将候选基因3′端和5′端序列拼接成全长cDNA序列。 5.运用生物信息学方法分析候选基因同源性和蛋白的基本物理化学特性。 6.通过原核表达系统分析克隆基因的表达和蛋白功能活性。 【结果】 GC-MS检测分析结果表明，6种微藻的脂肪酸含量介于1.88-5.77％之间，其中以绿色巴夫藻的脂肪酸最高，达到干重的5.77％。绿藻纲(Chlorophyceae)的微绿球藻和小球藻以16∶0、18∶2(n-6)、18∶3(n-3)为主要的脂肪酸，而EPA、DHA可能含量因为极低或不含有而未能检出；金藻纲(Chrysophyceae)的湛江等鞭金藻和绿色巴夫藻中14∶0、16∶0、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、DHA含量较高，湛江等鞭金藻DHA含量达到总脂的15.75％、绿色巴夫藻EPA、DHA的含量分别达到总脂的23.95％和4.83％；硅藻纲(Bacillariophyceae)的角毛藻和三角褐指藻中14∶0、16∶0、16∶1、EPA含量都较高，其中角毛藻EPA含量达到总脂的20.37％，三角褐指藻的EPA含量达到总脂的21.36％。通过检测6种经济微藻中不饱和脂肪酸的含量和组成，可筛选出富含多不饱和脂肪酸的微藻，为本实验下一步的完成提供条件。在分析部分微藻和高等植物中已克隆的脂肪酸去饱和酶基因序列的基础上，利用已知编码脂肪酸去饱和酶序列的相对保守片段设计引物，通过3’-RACE扩增出了5条未知功能的基因片段，经Blast同源性分析，其中一条可能是候选的脂肪酸去饱和酶基因，暂定名为B538。在获知了3′末端序列的基础上，设计两条距离相差100bp左右的特异性引物进行5′-RACE扩增，对扩出的5′末端构建克隆，经测序鉴定后，通过软件鉴定其正确性。利用Overlap-PCR将5′末端和3′末端连成全长的cDNA序列。序列分析发现，这一全长cDNA序列包含一个长为1161bp的ORF，编码一条387个氨基酸的蛋白质，其中蛋白分子量为43.64Ku，等电点为5.795，与蓖麻的delta 9脂肪酸去饱和酶具有51％的相似度。 根据已知的蓖麻△9脂肪酸去饱和酶三维晶体结构，通过同源模建预测B538的三级结构及活性中心和底物结合部位。结果显示B538三级结构的活性中心和底物结合部位除1个氨基酸不同外，其余21个氨基酸都与蓖麻的△9脂肪酸去饱和酶完全相同。由此可以推测，克隆出的基因很可能为可溶性的Aeyl-ACP△9脂肪酸去饱和酶． 通过SDS-PAGE 分析原核表达B538融合蛋白时，在60Ku处出现了一条明显变粗的条带，大小与理论值相符。通过Bandscan 分析,B538-38的表达量达到了总蛋白的36.7％，B538-78达到了28.6％，蓖麻的delta 9脂肪酸去饱和酶基因的蛋白表达量达到了19.9％，线虫fat-1 脂肪酸去饱和酶没有出现明显的诱导带。Western-blotting结果显示带有His标签的四个蛋白都得到了表达。GC-MS检测结果显示，绿色巴夫藻B538基因表达后导致的C18∶1和C18∶3的增加相对于对照空载具有统计学意义的。考虑到原核表达的融合蛋白包含一个150个氨基酸的标签，所以该基因的功能还需进一步的分析。 【结论】 初步建立了一种简便、快速的微藻脂肪酸去饱和酶基因cDNA快速筛选、克隆和鉴定方案。筛选克隆出的脂肪酸去饱和酶基因之一(B538)很可能是一种新发现的可溶性的．Acyl-ACP脂肪酸去饱和酶。