禽流感(Avian Influenza,AI)是由正黏病毒科、流感病毒属的禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的综合性传染疾病。H9N2为家禽低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)亚型之一,最早于1966年提取自北美的火鸡,我国自1994年在广东从鸡中分离出。H9N2亚型禽流感一直是我国禽流感流行的主型,并广泛存在于我国大部分地区,是威胁家禽养殖业的最主要疾病之一。大量研究及本课题组前期试验已证实,H9N2亚型AIV主要影响家禽的呼吸、消化及生殖系统功能,且出现一些神经症状和神经损伤。对流感病毒的神经症状机理的研究,多以小鼠为模型,证实流感病毒可感染其脑组织,而禽类感染H9N2 AIV后对神经系统的致病性及其机理的研究鲜有报道。为了揭示鸡感染H9N2 AIV后在中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的病毒分布情况及引起的免疫应答,本研究用H9N2亚型AIV人工滴鼻感染70日龄无特定病原(Specific Pathogen Free,SPF)鸡,分别采用直接免疫荧光、实时荧光定量PCR和免疫荧光双标记法检测了不同感染时间鸡大脑和小脑中核蛋白(Nucleoprotein,NP)的分布、免疫相关基因mRNA的表达变化以及CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞浸润情况。获得以下主要试验结果:1.人工感染H9N2亚型AIV鸡模型的建立SPF鸡30只,其中25只滴鼻接种H9N2AIV病毒原液3 mL,其余5只为空白对照组。在感染第2 d、4 d、6 d、8 d、15 d随机选取人工感染鸡5只,采取脑组织。通过绝对定量法检测出H9N2 AIV的M基因的CT值,根据实验室已建立的标准曲线计算大、小脑的病毒载量;采用免疫荧光双标检测感染H9N2 AIV鸡脑组织中NP蛋白的分布。结果发现,H9N2 AIV在感染第4 d病毒含量最高,其中大脑为1269.685copies/0.1g、小脑为804.67copies/0.1g;在感染第15 d后恢复健康,对照组未检测到病毒载量。在大脑,NP蛋白主要分布在神经元及神经胶质细胞的胞质中,部分细胞核中也有分布;在小脑,NP蛋白主要分布在颗粒层及分子层中神经元的细胞质中;在感染第4 d脑中NP蛋白阳性细胞数最多,与病毒载量的表达趋势相一致。表明成功建立人工感染H9N2亚型AIV鸡模型,且病毒可在脑中复制。2.感染H9N2 AIV鸡脑组织中免疫相关基因mRNA的表达Real-time PCR检测感染H9N2 AIV鸡脑组织中Toll样受体(TLR3/TLR4/TLR7/TLR21)、MDA-5、细胞因子(IL-2/IL-6/IFN-α/IFN-β)、趋化因子及受体(CXCLi1/CXCLi2/XCL1/XCR1/CCR5)及抑炎性因子(IL-4/IL-10/TGF-β1/TGF-β2)的mRNA含量。结果显示,TLR3/7/21及MDA-5基因在脑组织中的含量在第2 d呈上调趋势,TLR21基因在第4 d较对照组极显著上调(P<0.001);IL-2基因在第4 d极显著上调(P<0.001),其后表达水平下降;而IL-6/IFN-α/IFN-β基因表达含量在感染前4 d升高但较对照组差异不显著(P﹥0.05),在第6 d出现下调的趋势;CXCLi1、CXCLi2、XCL1、XCR1、CCR5在感染初期都表现出上调的趋势,其中XCL1及XCR1上调趋势较对照组极显著(P<0.001)。IL-4在第2 d出现极显著上调的趋势(P<0.001),其后表达水平下降;TGF在脑组织中出现下调的趋势,但较对照组差异不显著(P﹥0.05)。其中大脑的免疫相关基因表达变化趋势较小脑规律,在大脑和小脑中随着不同感染时间呈现出不同程度的表达变化,具体表现为时间依赖性。3.感染H9N2 AIV鸡脑组织中CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞浸润情况检测发现,鸡感染H9N2 AIV后,大脑、小脑组织CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞的数量随感染时间的延长而逐渐增多,且感染组明显多于对照组,在感染第4 d和第6 d数量达到最多;其中大脑中CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞分布较散,在小脑中两种淋巴细胞主要集中在颗粒层。这两种淋巴细胞在脑组织中的数量存在差异,CD3+CD8α+淋巴细胞明显多于CD3+CD4+,表明CD3+CD8α+淋巴细胞可能在炎症发生及病毒清除中发挥主要作用。以上结果表明,人工感染的H9N2亚型AIV能在鸡脑组织中存活复制,感染呈一定时间和部位相关性地引起鸡脑组织免疫相关基因mRNA的表达以及CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴细胞的浸润。为揭示鸡脑组织感染H9N2 AIV产生的神经症状、病理变化及免疫应答机制提供了一定的理论基础。