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一、研究背景
胶质瘤是一种最常见的颅内恶性肿瘤，占所有原发性颅内肿瘤的40％—60％，年发病率为10/10万，绝大多数恶性程度较高，预后较差。恶性胶质瘤平均存活期仅为9-12个月，5年生存率低于5.5％。恶性胶质瘤由于其浸润性生长，易于复发，所在区域功能重要等原因，治疗效果很不理想。目前胶质瘤的治疗仍然是以手术切除为主，辅以放疗化疗的综合治疗。在胶质瘤的临床基础研究方面，基因治疗仍然是研究的热点。基因治疗主要由三个核心部分组成，即目的基因、基因载体系统和基因表达系统。选择有效的转移基因显然是取得良好治疗效果的最重要因素。
胶质瘤的病因迄今为止尚未完全明确，是一个涉及多基因的过程，主要与遗传因素、胚胎发育因素、物理化学因素、病毒感染因素等密切相关。胶质瘤发病机制复杂，涉及癌基因的活化和抑癌基因的失活、细胞的瘤变、凋亡抵抗、自主生长信号的产生、新生血管的出现、免疫逃避、侵袭性的获得等等。抑制胶质瘤增殖、细胞毒作用、诱导胶质瘤凋亡以及抑制胶质瘤血管生成是胶质瘤治疗的主要方法和途径，相关基因也是基因治疗研究的重点。
近年来研究发现，生长抑制因子4(ING4)基因在抑制肿瘤生长、促进肿瘤凋亡、恢复细胞间的接触抑制、影响细胞周期进程、抑制肿瘤血管生成、增强肿瘤对细胞毒药物的敏感性等方面有重要作用。ING4基因定位于12p13.31，由8个外显子与七个内含子组成，大小约13000个bp，人的ING4基因ORF长度为747bp，编码约249个氨基酸残基，具有核定位信号以及C末端高度保守的PHD锌指结构域。研究发现，ING4表达水平与胶质瘤的恶性程度成反比，不同级别的胶质瘤的ING4表达具有明显差异。这说明ING4基因可能与胶质瘤的发病机制密切相关，因此研究ING4基因对胶质瘤的治疗作用及其机制具有重要意义。ING4基因是否能抑制胶质瘤增殖、诱导其凋亡目前需要解决的首要问题。
目前，广泛使用的基因表达系统之一是pEGFP质粒，pEGFP质粒含有GFP基因和卡那霉素/新霉素抗性基因，能在真核细胞中表达绿色荧光蛋白GFP和卡那霉素/新霉素抗性。因此，在转染后，可以通过G418筛选和GFP流式细胞分选系统筛选，获得阳性转染株。构建携带ING4的真核表达载体是研究该基因功能的基础。pEGFP质粒介导的目的基因可以实现在宿主细胞中的高表达，从而达到基因治疗的目的。
二、研究目的
1.构建携带ING4基因的真核表达载体pEGFP—ING4；
2.pEGFP—ING4转染U251，筛选阳性克隆；
3.分析ING4在pEGFP—ING4转染的U251中的表达；
4.探讨pEGFP—ING4对U251细胞株的增殖、凋亡的影响；
三、实验方法
1.生物信息学分析ING4基因：运用ORF Finder、TargetP、TMpred、SignalP、Conserved Domains在线软件对ING4进行开放读码框分析、亚细胞定位分析、跨膜区分析、信号肽分析、结构域分析。
2.重组质粒pEGFP—ING4的构建：①运用Premier Primer5、PCR design软件设计ING4的引物。②从人胎盘组织中提取总RNA，通过RT—PCR获得cDNA，PCR钓取目的基因。③TA克隆，将目的片段连接到pGEM—T载体上，转化、扩增、提取质粒，酶切鉴定。④双酶切阳性TA克隆质粒和pEGFP载体，电泳后切胶回收。将目的片段和pEGFP载体连接，转化、扩增、提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定。
3.细胞转染及阳性克隆的筛选：pEGFP质粒和pEGFP—ING4质粒分别转染U251。运用G418(800μg/ml)筛选法、流式细胞分析分选系统分选法筛选GFP阳性及卡那霉素/新霉素抗性U251细胞。pEGFP—ING4转染组为阳性组，pEGFP转染组为阴性对照组，未转染组为空白实验组。
4.分析ING4在各组细胞中的表达：运用免疫组化法分析上述三个不同实验组细胞中ING4的表达；运用western—blot法检测上述三个不同实验组ING4蛋白的表达和内参beta—actin的表达，用Image—Pro Plus6.0软件分析条带的光密度值。
5.细胞增殖实验和凋亡实验：用MTT、法检测上述三个不同实验组细胞增殖，统计各组OD492值。用Hochest染色法分析上述三个不同实验组的细胞凋亡数，并计算凋亡率。
6.统计分析：采用SPSS软件。三个不同实验组的光密度值、OD492值、凋亡率均采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为有统计学意义。
四、结果
1.重组质粒pEGFP—ING4的鉴定：pEGFP—ING4质粒经过双酶切后，电泳发现在10000bp附近和1000bp附近各有一条荧光条带，其长度和pEGFP以及ING4相符。pEGFP—ING4经过测序分析后比对没有发现碱基突变。
2.ING4各组中的表达：①免疫组化分析发现，pEGFP—ING4转染组的细胞有棕黄色着色，细胞核着色较深，其他两组细胞未见棕黄色着色。②western—blot分析发现，pEGFP—ING4转染组在30KD附近有一条条带，与ING4分子量相一致，其光密度值高于其他两组，P<0.05；pEGFP转染组和未转染组30KD附近的光密度值差异没有统计学意义，P>0.05；各组在30 KD最上方均有一条内参beta—actin的条带，各组光密度值的差异没有统计学意义，P>0.05。
3.MTT实验：细胞接种后第1天、第3天、第5天，pEGFP—ING4转染组的OD492呈下降趋势。pEGFP—ING4转染组的U251在接种后第3和第5天的OD492低于pEGFP转染组和未转染组，其差异具有统计学意义，P<0.05。
4.Hochest实验：pEGFP—ING4转染组的U251在培养第3天出现了较多的细胞凋亡，其凋亡率高于其他两组，其差异具有统计学意义，P<0.05。
五、结论
1)携带ING4的真核表达载体pEGFP—ING4构建成功；
2) ING4能在pEGFP—ING4转染组中高表达；
3) ING4能抑制U251生长、促进U251凋亡。