烟草花叶病毒运动蛋白(TMV MP)能与胞间连丝结合，并改变胞间连丝的结构使胞间连丝的最大通透能力提高5～10倍。将病毒运动蛋白注入植物细胞，它立即改变胞间连丝的通透性能，使大分子物质可以发生胞间转移。转基因植物研究发现，当遭受伤害或外来病毒入侵时，植物体内的MP蛋白可以经植物体微管系统向伤口部位积累，干扰入侵病毒复制和转移。本研究以TMV MP为研究对象，以绿色荧光蛋白green fluorescent protein的gfp基因作为报告基因，进行导向载体MP—GFP和MP的构建与表达研究，并以农药分子毗虫啉和溴虫腈活性成分与导向载体MP和MP—GFP偶合，构建导向农药分子，分别借助gfp报告基因和荧光染料为示踪物，研究偶合物在植物细胞间的运动情况。 ⑴用烟草花叶病毒普通株系接种烟草叶片，提取全基因组TMV RNA，反转录合成第一链cDNA。根据TMV mp的序列设计基因特异引物，扩增出mp基因的整个开放阅读框，将扩增出的片段连接到原核表达载体pET—22b(+)和pET—28b(+)上，分别克隆出表达载体pET—22b(+)—MP、pET—28b(+)—MP；从含有gfp基因的质粒pCR3.1上扩增出全长基因，设计引物，将扩增出的片段连接到载体pET—28b(+)上，得到质粒pET—28b(+)—GFP，将扩增出的片段分别连接到原核表达载体pET—28b(+)上，分别克隆出pET—28b(+)—MP—GFP和pET—28b(+)—GFP—MP。 ⑵将上述阳性克隆转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中，优化影响重组大肠杆菌pET—22b(+)—MP(E. coli BL21(DE3))和pET—28b(+)—MP—GFP(E. coli BL21(DE3))的菌体生长和目的蛋白表达条件如培养温度、诱导剂浓度、诱导时间、诱导时机等，确定了菌体生长和蛋白表达的最佳条件。pET—28b(+)—MP—GFP(E.coli BL21(DE3))表达产物的重组蛋白细胞内定位分析，表达的融合蛋白MP—GFP是以包涵体形式存在，目的蛋白MP—GFP的最佳表达条件为：接种量为培养基总体积的4％，培养温度37℃，培养2h后，加入0.2 mmol/L的IPTG，在25℃下诱导培养4h。pET—22b(+)—MP(E.coli BL21(DE3))表达产物的重组蛋白细胞内定位分析表明表达的融合蛋白MP是以部分可溶性形式存在，目的蛋白MP的最佳表达条件为：接种量为培养基总体积的4％，培养温度37℃，培养4h后，加入1.0 mmol/L的IPTG，在35℃下诱导培养5h。经过生物反应器发酵大规模培养重组大肠杆菌pET—28b(+)—MP—GFP(E. coli BL21(DE3))和pET—22b(+)—MP(E. coli BL21(DE3))，获得大量的目的蛋白MP—GFP和MP。经亲和层析方法分离出蛋白MP—GFP和MP，纯度分别达到96.2％和97.6％；经过免疫印迹反应检测，表达出的蛋白均是目的蛋白。 ⑶采用化学方法合成了吡虫啉中间体(IM—COOH)和溴虫腈中间体(CFP—NH2)，借助蛋白质与小分子偶合技术，分别采用活性酯法和戊二醛法使IM—COOH和CFP—NH2与蛋白MP和MP—GFP偶合，经过紫外扫描确认，IM—COOH和CFP—NH2与蛋白得到有效偶联，制备得到偶合物IM—COOH—MP、CFP—NH2—MP、IM—COOH—MP—GFP和CFP—NH2—MP—GFP。 ⑷通过显微注射技术，将偶合物注射进入烟草叶肉细胞和洋葱表皮细胞中，偶合物CFP—NH2—MP和CFP—NH2—MP—GFP在注射后的5 min和30 min，可以在烟草叶肉细胞和洋葱表皮细胞发生移动，偶合物CFP—NH2—MP和CFP—NH2—MP—GFP具有一定的运动功能。 ⑸当植物遭遇外源性伤害时，植物体内的MP可以经过植物微管传导系统运输，迅速向伤口部位聚集，从而限制外源性病毒粒子的复制与转移。重组蛋白表达后同时具有运动特性及荧光标记双重功能，TMV MP可以作为导向农药的导向载体，介导农药分子在植物体内的传导和运动。