背景:与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin hemology deleted on chromosome ten gene,PTEN)是磷酸酶家族中发现的首个抑癌基因,PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性,其脂质磷酸酶活性可以将3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)3位上的磷酸基团去掉,使PIP3转化为4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),此功能在于调控细胞的增殖与凋亡。其蛋白磷酸酶活性可以抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、黏着斑激酶(FAK)的磷酸化,调节细胞的迁移及黏附。PTEN通过上述多种信号传导通路影响细胞生长、分化、黏附及细胞周期进程,抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移,并促进肿瘤细胞凋亡。研究发现在多种实体瘤中存在PTEN基因的突变、等位基因的缺失或低表达,从而影响其肿瘤抑制功能,并与部分肿瘤的预后不良密切相关。近年来PTEN在造血系统肿瘤,如白血病发病中的作用逐渐受到重视,研究表明PTEN基因在白血病中存在不同程度的缺失、低表达、甲基化,而突变罕见。造血细胞PTEN基因突变或缺失的小鼠最初可以出现类似于人类骨髓增殖性疾病(MPD)表现,随后转化为急性髓系或淋巴细胞白血病,把PTEN基因突变或缺失的小鼠造血祖细胞移植到SCID鼠后,受体鼠亦发生白血病,并伴有白血病细胞髓外浸润。同时PTEN基因的表达水平对区分白血病干细胞和正常造血干细胞发挥了关键作用。国内外研究表明PTEN基因的异常可能参与了白血病的发病、多药耐药、血管新生及髓外浸润。PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡的作用在多种实体肿瘤细胞中已经得到证实,而在造血系统肿瘤如白血病中的作用及其机制尚不完全清楚。K562细胞系为人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞系,具有较高的PI3K/Akt活性,同时低表达PTEN基因及蛋白,为我们将外源性野生型PTEN基因进行转染提供了条件。因此我们将腺病毒介导的PTEN基因转染人白血病原代细胞及K562细胞系,观察野生型PTEN对白血病细胞增殖、凋亡、侵袭、细胞周期进程、多药耐药及血管新生的影响,并检测其可能的作用机制,为基因治疗白血病提供理论依据。研究分以下三部分:第一部分腺病毒介导的野生型PTEN基因对人慢性粒细胞白血病细胞系K562及原代白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响目的探讨肿瘤抑制基因PTEN对人原代白血病细胞及K562细胞系增殖、凋亡及细胞周期的影响,并对其可能的作用机制进行初步探讨。方法将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad- PTEN-GFP)或空载体腺病毒(Ad-GFP)转染人原代白血病细胞及K562细胞系。MTT检测细胞生长曲线;流式细胞仪检测腺病毒转染细胞的转染效率、细胞凋亡率和细胞周期分布;光镜下检测细胞形态变化,DNA ladder,Hoechst33342荧光染色检测、细胞集落形成等实验检测细胞增殖及凋亡。荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Survivin、Xiap、Smac、Caspase-3、-7、-9、CyclinD1、CyclinD2、CDK4、P27kip1 mRNA水平变化,Western Blot检测PTEN、Bcl-2、Akt、p-Akt水平变化。Caspase活性检测试剂盒检测Caspase-3/7、Caspase-9蛋白活性。结果1当MOI为200时,转染第三天用流式细胞仪检测腺病毒转染K562细胞效率最高为81.2±5.4%。通过计数绿色荧光细胞数量检测转染原代细胞效率较低,选取了5例原代白血病细胞,平均转染效率为7.32±6.41%。2当MOI为200时在转染第3天PTEN mRNA及蛋白表达水平达到最高。转染后d3,Ad-PTEN-GFP组PTEN表达mRNA水平(23.58±4.52)及蛋白表达水平(0.912±0.102)高于Ad-GFP组的mRNA(0.650±0.516)及蛋白(0.117±0.028)表达水平和未转染对照组的mRNA(0.575±0.226)及蛋白(0.086±0.021)表达水平,均P<0.01。3 Ad-PTEN-GFP以感染复数为200转染细胞后第5天与空载体腺病毒(Ad-GFP)相比,Ad-PTEN-GFP转染人原代白血病细胞后,细胞增殖受抑,对转染的5例原代细胞增殖抑制率为33.8±10.4%。Ad-PTEN-GFP以感染复数为200转染K562细胞后第5天,细胞最大生长抑制率为38.67%,明显高于Ad-GFP组的抑制率5.34%。Ad-PTEN-GFP组细胞凋亡率为22.4±2.11%,明显高于Ad-GFP组的2.8±0.67%和未转染组的0.2±0.02%,均P<0.05。4腺病毒转染K562细胞5天后,未转染组及Ad-GFP转染组的细胞呈圆形或椭圆形,体积较大,染色质疏松;转染Ad-PTEN-GFP组部分细胞体积缩小,染色质高度浓缩边集,核碎裂核溶解。Hoechst33342荧光染色显示正常细胞核Hoechst着色的形态呈圆形,淡蓝色;而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色。转染Ad-PTEN-GFP组细胞凋亡细胞比例(35.6±2.2%)明显高于未转染组(3.1%±1.13%)和转染Ad-GFP组(6.2%±0.87%),均P<0.01。5以MOI=200腺病毒转染K562细胞5天后,Ad-PTEN-GFP组DNA琼脂糖凝胶电泳出现大小为180至200bp及其倍数的梯状条带,片断之间呈一定间隔,这是DNA在核小体间成倍断裂的结果,Ad-GFP组及未转染组细胞未出现DNA降解现象。6细胞周期显示以MOI=200 Ad-PTEN-GFP转染K562细胞7天,G0/G1期细胞比例由54.9±3.61%增加至78.5±5.17%(P<0.05),G2/M期细胞比例由30.2±2.42%降至13.6±2.01%,(P<0.05),处于G0/G1期细胞比例逐渐增加,处于G2/M期细胞比例逐渐减少,细胞周期阻滞在G0/G1。7当MOI为200时,K562细胞转染Ad-PTEN-GFP第三天Western blot检测Akt及p-Akt结果显示,总Akt表达水平无明显变化,而p-Akt表达水平在未转染组、转染Ad-GFP组、转染Ad-PTEN-GFP组分别为(0.587±0.078;0.547±0.061;0.021±0.011),转染PTEN 3d后p-Akt表达水平明显减低(P<0.01)。8以MOI=200转染K562细胞系3天后,Ad-PTEN-GFP组细胞内Caspase-9活性(0.786±0.032)、Caspase-3/7活性(1.362±0.039),均高于Ad-GFP组的Caspase-9(0.591±0.024)和Caspase-3/7(1.103±0.024)活性,(P<0.05)。9以MOI=200转染K562细胞系3天后,Ad-PTEN-GFP组细胞内Survivin(0.0700±0.0059)、Xiap(0.00889±0.0006)、Smac (0.0600±0.0039) mRNA表达水平均明显低于Ad-GPF组细胞内Survivin(0.437±0.079)、Xiap(0.0661±0.0072)、Smac(0.158±0.0078)和未转染组K562细胞内Survivin(0.453±0.081)、Xiap(0.070±0.0079)、Smac(0.177±0.0085) mRNA表达水平,转染Ad-PTEN-GFP后与转染Ad-GFP相比Survivin mRNA表达水平降低6.14倍、Xiap降低7.44倍,而Smac mRNA降低2.95倍。10以MOI=200转染K562细胞系3天后,未转染组、转染Ad-GFP组、转染Ad-PTEN-GFP组凋亡相关基因的表达水平分别为,Bcl-2 mRNA:0.732±0.078、0.723±0.148、0.195±0.043;Bcl-xL mRNA:0.0181±0.0009、0.0176±0.0011、0.0047±0.0008;Bax mRNA :0.376±0.031、0.395±0.036、0.912±0.117。结果显示未转染组、Ad-GFP组与转染Ad-PTEN-GFP组各基因的表达水平有明显差异,均P<0.01。转染野生型PTEN后Bcl-2与Bcl-xL抗凋亡基因表达减低,而促凋亡基因Bax mRNA表达升高,Bcl-2蛋白表达水平下调,分别为(1.016±0.147;0.996±0.166;0.582±0.067)。Bcl-2/Bax mRNA表达水平由Ad-GFP组1.83降至Ad-PTEN-GFP组0.214,降低8.55倍。11以MOI=200转染K562细胞系3天后,细胞周期相关基因的检测结果显示,未转染组、转染Ad-GFP组、转染Ad-PTEN-GFP组分别如下:CyclinD1 mRNA (0.711±0.174;0.698±0.162;0.243±0.102)、CyclinD2 mRNA (0.123±0.0196 ; 0.106±0.0178 ; 0.0441±0.0144)、CDK4 mRNA (0.859±0.165;0.876±0.142;0.272±0.092)、P27kip1 mRNA (0.0721±0.0102;0.0683±0.00883;0.470±0.172)。与未转染组和转染Ad-GFP组比较,转染Ad-PTEN-GFP后CyclinD1、CyclinD2、CDK4 mRNA表达水平明显下调(均P<0.05),而P27kip1 mRNA表达水平升高(各组P<0.05)结论高表达PTEN基因能够明显抑制原代白血病细胞和K562细胞增殖并诱导凋亡,可能与PTEN抑制PI3K/Akt信号通路,并调控多种凋亡相关分子家族基因如Bcl-2家族、Caspase家族和IAP家族密切相关,并通过调控细胞周期相关分子表达使细胞周期阻滞在G0/G1期。第二部分腺病毒介导的野生型PTEN基因对人慢性粒细胞白血病阿霉素耐药细胞系K562/ADM多药耐药逆转的研究目的探讨野生型抑癌基因PTEN对人慢性粒细胞白血病阿霉素耐药细胞系K562/ADM增殖、凋亡的影响,及其与多种化疗药物联合应用的协同作用进行研究,并对其逆转多药耐药的分子作用机制进行探讨。方法用携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad- PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)转染对阿霉素耐药的慢性粒细胞性白血病细胞株K562/ADM细胞系,和或联合应用阿霉素(ADM)、阿糖胞苷(Ara-c)、三氧化二砷(As2O3)等不同类型化疗药物,观察PTEN基因与化疗药物的协同作用。MTT检测细胞生长曲线,计算不同药物的IC50及联合作用的IC50,计算耐药逆转倍数;流式细胞仪检测腺病毒转染K562细胞的转染效率、细胞凋亡率;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN、NF-κB、I-κB、P53、MDR1、MRP1及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xL及Bax水平变化,Western Blot检测PTEN、Akt、p-Akt、P65蛋白水平变化。结果1当MOI为200时,转染第3天流式细胞仪检测腺病毒转染K562/ADM细胞效率最高,为82.2±5.8%。2当MOI为200时在转染第3天,K562/ADM细胞中的PTEN mRNA及蛋白表达水平达到最高。转染后d3,Ad-PTEN-GFP组PTEN mRNA表达水平(25.43±3.77)及蛋白表达水平(1.240±0.219)高于Ad-GFP组PTEN mRNA(0.473±0.117)及PTEN蛋白(0.105±0.014)表达水平和未转染对照组PTEN mRNA(0.477±0.071)及PTEN蛋白(0.073±0.011)表达水平(P<0.01)。而K562及K562/ADM细胞中的PTEN mRNA及蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。3以MOI为200转染K562/ADM细胞,第5天Ad-PTEN-GFP组增殖抑制率为32.26%,明显高于Ad-GFP组(3.31%),有明显统计学差异(P<0.01),与亲代K562细胞比较,PTEN基因对K562/ADM细胞的抑制率稍低,但两者差异无统计学意义(P>0.05)。4流式细胞凋亡检测显示以MOI为200转染K562/ADM细胞后,Ad-PTEN-GFP联合10mg/L阿霉素(ADM)或5μmol阿糖胞苷(Ara-c)或1μmol/L三氧化二砷(As2O3)干预组细胞凋亡率分别为:17.8±2.3、28.6±2.9、61.7±3.2,明显高于转染Ad-GFP后联合各化疗药物组的凋亡率:2.3±0.7、15.2±1.8、20.4±2.1,三者均有显著性差异(P<0.01)。5以MOI为200转染K562/ADM细胞后联合或单独应用ADM、Ara-c、As2O3等化疗药物72h后PTEN基因对不同化疗药物的耐药逆转倍数分别为ADM 3.8倍、Ara-c 2.64倍、As2O3 2.65倍。6当MOI为200时,转染Ad-PTEN-GFP第三天Western blot检测Akt及p-Akt结果显示,总Akt表达水平无明显变化,而p-Akt表达水平在未转染组、转染Ad-GFP组、转染Ad-PTEN-GFP组分别为:0.633±0.065、0.646±0.066、0.022±0.007;转染PTEN 3d后K562/ADM细胞p-Akt表达水平明显减低(P<0.01)。7以MOI=200转染K562/ADM细胞后3天,实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)结果显示在未转染组、Ad-GFP组、Ad-PTEN-GFP组,NF-κB mRNA与β-actin mRNA相对表达水平分别为16.08±2.85;15.20±2.08;1.17±0.06(P<0.05),转染PTEN基因后P65蛋白表达水平亦明显减低。I-κB相对表达水平分别为0.21±0.08;0.18±0.07;0.23±0.11,无明显差异(P>0.05)。P53 mRNA与β-actin mRNA的相对表达水平分别为2.95±0.32;3.07±0.75;5.93±1.51,(P<0.05)。转染野生型PTEN基因后NF-κB mRNA及p65蛋白表达水平明显减低,p65蛋白活性呈时间依赖性减低。I-κB mRNA表达水平无明显改变,P53 mRNA表达水平轻度升高。8以MOI=200转染K562/ADM细胞3天后,FQ- PCR结果显示在未转染组、Ad-GFP组、Ad-PTEN-GFP组中MDR1 mRNA与β-actin mRNA相对表达水平分别为0.25±0.02;0.24±0.03;0.13±0.01(P<0.05)。MRP mRNA表达水平分别为0.44±0.07;0.42±0.07;0.47±0.09(P>0.05)。表明转染PTEN基因后MDR1 mRNA表达水平减低,而MPR mRNA表达水平无明显改变。9以MOI=200转染K562/ADM细胞3天后,FQ- PCR结果显示在未转染组、Ad-GFP组、Ad-PTEN-GFP组中Bcl-2 mRNA表达水平分别为0.040±0.013;0.036±0.010;0.011±0.004(P<0.05)。Bcl-xL mRNA表达水平分别为:0.0071±0.0003;0.0076±0.0003;0.0037±0.0001(P<0.05)。Bax mRNA表达水平分别为:0.129±0.028;0.141±0.018;0.432±0.071(P<0.05)。结果表明转染野生型PTEN基因后Bcl-2 mRNA、Bcl-xLmRNA表达水平明显减低,而Bax mRNA表达水平增加。结论野生型PTEN基因可能通过调控PI3K/Akt信号传导通路、抑制K562/ADM细胞增殖及诱导凋亡,并通过下调NF-κB、MDR1、Bcl-2及上调P53、Bax等多种信号分子,逆转K562/ADM细胞的多药耐药。第三部分PTEN基因对白血病细胞VEGF调控的研究及其临床意义目的探讨肿瘤抑制基因PTEN及血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR1(FLT1)在白血病中的表达和临床意义;研究野生型PTEN基因的抗血管新生作用。方法(1)应用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测50例初治急性髓系白血病(AML),10例缓解期AML,10例慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)、10例CML急变期(CML-BC)患者和10例健康人骨髓单个核细胞(MMNC)中PTEN、VEGF、VEGFR1 mRNA的表达。(2)将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)转染K562细胞系,观察不同感染复数(MOI)条件下PTEN基因对VEGF及FLT1表达的影响。(3)通过MTT及流式细胞术检测PTEN基因对脐静脉内皮细胞系ECV304增殖、凋亡的影响。(4)鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长实验方法检测PTEN基因对血管生成的影响。结果1 PTEN、VEGF、FLT1 mRNA在髓系白血病中的表达水平及相互关系。1.1 PTEN mRNA在急性髓系白血病(AML)初治患者中表达水平(0.051±0.059)明显低于AML缓解组(1.015±0.411)和正常对照组NC(1.059±0.595),(P<0.01);CML-BC患者中PTEN mRNA表达水平(0.022±0.021)低于CML-CP患者(1.134±1.124)及NC(P<0.01)。1.2 VEGF mRNA在AML初治患者中表达水平(0.442±0.192)明显高于AML缓解组(0.075±0.042)和NC(0.059±0.039),(P<0.01);CML-BC患者(0.512±0.322)VEGF mRNA表达水平高于CML-CP(0.219±0.131)及NC(P<0.01)。1.3 FLT1 mRNA在AML初治患者中表达水平(1.569±0.694)明显高于AML缓解组(0.375±0.241)和NC(0.402±0.238),(P<0.01);CML-BC患者中FLT1 mRNA表达水平(1.579±0.623)高于CML-CP(0.598±0.311)及NC(P<0.01)。1.4 Pearson直线相关法分析显示,AML患者中PTEN mRNA与VEGF mRNA呈负相关(r=-0.631,P<0.05),与FLT1 mRNA表达同样呈负相关(r=-0.522,P<0.05)。2 PTEN基因对K562细胞系的侵袭性及p-Akt、VEGF及FLT1调控的研究2.1当MOI为200时,转染第三天流式细胞仪检测腺病毒转染K562细胞效率最高为81.2±5.4%,符合基因治疗对载体的要求。2.2当MOI为50、100、200、400转染K562细胞系后,转染72h内随着PTEN mRNA表达水平升高,VEGF、FLT1 mRNA表达水平逐渐降低,呈负相关趋势,相关系数分别为:r=-0.903,P<0.05;r=-0.900,P<0.05;VEGF蛋白表达水平同样降低。当MOI=200时PTEN mRNA表达水平增加到41.01倍,VEGF、FLT1 mRNA表达水平下调分别为4.80倍和4.68倍,ELISA方法显示VEGF蛋白表达水平下调2.21倍。2.3当MOI为200时,转染Ad-PTEN-GFP第三天Western blot检测总Akt及p-Akt结果显示,总Akt表达水平无明显变化,而p-Akt表达水平在未转染组、转染Ad-GFP组、转染Ad-PTEN-GFP组分别为0.587±0.078、0.547±0.061、0.021±0.011,转染PTEN 3d后p-Akt表达水平明显减低(P<0.01)。2.4 Transwell侵袭实验显示在MOI=200时,Ad-PTEN-GFP转染K562细胞48h后,400倍显微镜下计数10个视野内黏附于下室面有荧光的细胞数量,取平均值计数Ad-GFP组、Ad-PTEN-GFP组的细胞数分别为50±11和24±6(P<0.01),PTEN基因转染后明显抑制K562细胞侵袭性。3 PTEN基因对人脐静脉内皮细胞系ECV304增殖及凋亡的影响。3.1以MOI为100转染ECV304细胞,MTT检测细胞增殖,结果显示第5天Ad-PTEN-GFP组最大增殖抑制率为50.38±4.15%,明显高于Ad-GFP组4.28±0.73,(P<0.01)。3.2流式细胞凋亡检测显示以MOI为100转染ECV304细胞5天后,Ad-PTEN-GFP组细胞凋亡率为18.56±2.11,明显高于Ad-GFP组2.86±1.01及未转染组1.34±0.32,(P<0.01)。4鸡胚尿囊膜血管生成实验结果显示生理盐水组及Ad-GFP处理组鸡胚尿囊膜血管生长良好,呈树枝状,分支适中,Ad-PTEN-GP干预组出现比较明显的血管稀疏区及苍白的无血管区,血管数目明显减少。Ad-GFP组、Ad-PTEN-GFP组血管指数分别为92.2±4.37%与47.6±3.37%,两者比较差异有显著性(P<0.05)。结论:1.在AML细胞中PTEN基因低表达,并且与VEGF和FLT1基因呈负相关。2. PTEN基因通过抑制PI3K/Akt通路,下调VEGF及FLT1表达,抑制白血病细胞侵袭及血管新生。