在世界范围内,结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是第三大最常见的恶性肿瘤,位列肿瘤相关死亡的第二大原因,2020年全球新增病例约180万例,死亡约88万例。结直肠癌的分布具有明显的地域差异,我国是高发国家。由于饮食结构改变、人口老年化、吸烟及缺乏锻炼等多种因素,结直肠癌已经成为危害人民身体健康,增加社会负担的重要因素。早期筛查率低、进展期病例多是我国结直肠癌的特点。虽然近年来结直肠癌的综合治疗手段有显著改善,但总体治疗效果不容乐观。此外,结直肠癌具有发病机制复杂、病理类型多样、时空异质性等特点,对常规放化疗易产生耐受,影响治疗效果。因此,深入研究结直肠癌的发生发展的分子机制,寻找影响肿瘤进展的关键分子,探索新的治疗模式,将是今后结直肠癌研究领域的重要工作。随着基因组学及二代高通量测序等研究技术的开展,将结直肠癌组织及相应癌旁组织进行高通量测序,利用生物信息学分析技术筛选出差异基因,进行深入的功能及机制研究,从而探寻结直肠癌治疗新靶点,为结直肠癌的诊断和治疗提供新的理论和实验基础。本研究通过查询结肠癌公共数据库,经过生物信息学结合病人生存情况进行深入分析,选定SLCO1B3作为研究对象。分析研究了其在结肠癌中的表达及与患者临床分期和预后的关系,并进行了结肠癌细胞体内外增殖、迁移侵袭的研究,初步探讨了其可能的作用机制。本研究共分以下四部分内容。第一部分SLCO1B3的筛选、在结肠癌中的表达及其与临床病理特征及患者预后的相关性目的:筛选结肠癌与癌旁组织中的关键差异基因,检测SLCO1B3在结肠癌及癌旁组织中的表达水平,并分析SLCO1B3mRNA表达水平与临床病理特征和患者生存的相关性。方法:1.从GEO数据库下载了结肠癌及癌旁组织二代测序结果,GSE123734数据集,按P-value＜0.05和|log FC|＞3标准对GSE123734数据集进行深入分析,对DEGs进行了PPI网路分析,使用cytoscape工具MCODE插件分析差异基因在结直肠癌调控网络中的重要作用。2.收集新鲜结肠癌组织标本和配对癌旁组织标本96对,利用q RT-PCR法检测癌组织与癌旁正常组织中SLCO1B3的表达水平。3.收集患者的临床病理资料并随访生存时间,分析SLCO1B3 mRNA的表达水平与结肠癌临床病理资料及患者生存之间的相关性。4.采用χ~2检验、t检验分析结肠癌组织中SLCO1B3mRNA的表达水平与肿瘤T、N、M分期及肿瘤分化程度间的相关性。采用Kaplan-Meier及Log-rank检验分析SLCO1B3 mRNA表达水平与患者生存期的相关性。结果:1.分析GSE123734数据集,结果得到结肠癌的差异表达基因共有272个,其中上调DEGs有117个,下调的DEGs有155个。对差异表达基因进行差异表达基因的GO（gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析,PPI网路分析发现SLCO1B3基因在结直肠癌调控网络中发挥关键作用,最终选择SLCO1B3做为本研究的目的基因。2.结肠癌组织中SLCO1B3mRNA表达水平较癌旁正常组织显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.结肠癌组织中SLCO1B3的mRNA高表达与肿瘤分化水平及T、N、M分期有显著相关性（P＜0.05）,与肿瘤部位、大小等其它临床病理学指标之间无显著相关性（P＞0.05）。4.肠癌组织中的SLCO1B3 mRNA表达与总生存期（Overall survival,OS）呈负相关,高表达预示较差的总生存期。小结:1.SLCO1B3的mRNA在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。2.SLCO1B3的mRNA表达水平与肿瘤分化等级、侵润深度、淋巴结转移、远处转移有明显相关性。3.SLCO1B3的mRNA高表达预示结肠癌患者不良预后。第二部分SLCO1B3对结肠癌细胞生物学功能的影响目的:探讨SLCO1B3在体外对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法:1.采用q RT-PCR及Western Blot方法检测正常结肠粘膜上皮细胞株及不同结肠癌细胞株中SLCO1B3在mRNA及蛋白质水平的表达。2.设计小干扰RNA（Small interferingRNA,siRNA）:si1-SLCO1B3、si2-SLCO1B3、si3-SLCO1B3及阴性对照si-NC,转染结肠癌细胞SW480及HCT116,并通过q RT-PCR及Western Blot法检测SLCO1B3的敲低效率。3.采用细胞克隆技术和细胞增殖实验（MTS）检测敲低SLCO1B3对结肠癌细胞的克隆和增殖能力的影响。4.采用划痕实验及Transwell实验检测敲低SLCO1B3对结肠癌细胞的迁移、侵袭能力的影响。结果:1.相较于NCM-460细胞,SLCO1B3在SW480、SW620、HCT116、HT29和RKO细胞株中均明显高表达。本研究中选择SLCO1B3表达水平较高的HCT116与SW480作为研究对象。2.HCT116和SW480细胞转染siRNA后,与阴性对照组（si-NC）细胞相比,si1-SLCO1B3与si2-SLCO1B3对SLCO1B3表达抑制能力较好（P均＜0.01）。3.与si-NC组相比,敲低SLCO1B3可导致HCT116与SW480细胞增殖以及克隆能力明显降低（P均＜0.01）。4.Transwell实验及划痕实验显示,与si-NC组细胞相比,敲低SLCO1B3可显著抑制人结肠癌细胞株HCT116和SW480细胞迁移及侵袭能力（P均＜0.01）。小结:1.SLCO1B3在HCT116和SW480中高表达,选择此两种细胞株进行后续实验研究。2.转染si1-SLCO1B3与si2-SLCO1B3可显著抑制HCT116和SW480细胞株SLCO1B3的表达水平。3.敲低SLCO1B3可导致HCT116和SW480细胞增殖及克隆能力降低4.敲低SLCO1B3可导致HCT116和SW480细胞的迁移和侵袭能力显著降低。第三部分敲低SLCO1B3对结肠癌细胞裸鼠皮下成瘤及肝肺转移瘤的影响目的:通过构建裸鼠皮下成瘤及肺肝成瘤模型,探索敲低SLCO1B3基因对裸鼠皮下成瘤及肝肺成瘤形成能力的影响。方法:1.采用慢病毒转染技术构建低表达SLCO1B3的稳转细胞株HT29和HCT116（sh-SLCO1B3）作为实验组,同时构建阴性转染对照组细胞株（sh-Control）。采用q RT-PCR及Western Blot法检测慢病毒敲低效率。2.取sh-SLCO1B3 HCT116细胞予以裸鼠皮下注射制作移植瘤模型;另取sh-SLCO1B3 HT29细胞予以裸鼠尾静脉注射制作肝肺转移瘤模型,同时构建阴性对照组模型。3.每3天记录裸鼠皮下瘤的体积,至24天处死裸鼠,记录皮下瘤的体积及重量。4.经尾静脉注射10周后,处死裸鼠,留取肺组织及肝组织标本行HE染色,分析各组裸鼠肺脏与肝脏转移瘤的生成情况。结果:1.与sh-Control相比,转染sh-SLCO1B3可导致细胞SLCO1B3mRNA及蛋白表达水平明显降低（均P＜0.05）。2.与sh-Control组相比,敲低SLCO1B3可导致皮下瘤生长速度减慢,肿瘤体积、重量明显降低（均P＜0.05）。3.敲低SLCO1B3组裸鼠较对照组肝转移瘤发生率（33.3%vs.100%）,肺转移瘤发生率（16.7%vs.50%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.成功构建敲低SLCO1B3的稳转HCT116和HT29细胞株。2.敲低SLCO1B3的表达可显著减慢裸鼠皮下移植瘤的生长。3.敲低SLCO1B3的表达可显著降低裸鼠肺转移与肝转移的发生率。第四部分SLCO1B3通过作用STAT3促进结肠癌的发生及转移的机制研究目的:探索SLCO1B3的下游作用分子及关键信号通路,进一步揭示SLCO1B3影响结肠癌细胞生物学功能的机制。方法:1.利用NGS技术,将敲低SLCO1B3的HCT116细胞（si1-SLCO1B3）及对照组细胞（si-NC）进行二代测序。2.对测序结果进行了mRNA微阵列分析和生物信息学分析,以筛选差异表达的基因（DEG）。3.对差异表达基因进行GO（gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析筛选通路。4.利用蛋白互作网络分析（PPI）数据库（https://www.string-db.org/）以及STRING数据库对差异基因进行处理生成互作网络。5.敲低SLCO1B3,检测HCT116细胞中STAT3、p-STAT3、MMP2、MMP9的表达水平。结果:1.HCT116细胞敲低SLCO1B3经二代测序后得到结肠癌的差异表达基因共有286个,其中上调DEGs有125个,下调的DEGs有161个。结果原始数据已上传至GEO数据库,编号:GSE163396。2.从GO通路图,发现IL6-JAK-STAT3通路是显著富集通路。3.SLCO1B3与STAT3相互作用且呈正相关（Pearson=0.372,P=0.01）。4.敲低SLCO1B3可导致HCT116细胞中p-STAT3/total-STAT3、MMP2、MMP9的表达明显降低（P＜0.05）。小结:1.对敲低SLCO1B3的HCT116细胞与对照组行二代测序2.对测序结果经生物信息学分析,发现SLCO1B3与STAT3相互作用,并且呈正相关。3.SLCO1B3通过调节STAT3磷酸化影响MMP2、MMP9的表达。结论:1.结肠癌组织中SLCO1B3表达水平显著升高,且与肿瘤分化等级、侵润深度、淋巴结转移、远处转移明显正相关。SLCO1B3高表达与患者的不良预后相关。2.体外敲低SLCO1B3,可明显抑制结肠癌细胞HCT116和SW480细胞增殖克隆、迁移、侵袭能力。3.敲低SLCO1B3可显著减缓裸鼠皮下瘤的生长速度,并减少裸鼠的肺转移与肝转移瘤的发生率。4.SLCO1B3通过作用于STAT3影响MMP2、MMP9的表达,促进结肠癌的进展。