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研究目的本实验通过培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,检测其在s FRP3及Wnt5a等因素干预下,碱性磷酸酶、胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)及胞内的β-catenin蛋白含量的变化,来探究s FRP3能否促进BMSCs成骨分化及是否通过Wnt信号通路影响间充质干细胞成骨分化,从而为治疗骨质疏松提供新的理论及方法。研究方法取4-6周龄大鼠股骨和胫骨骨髓腔内骨髓单个核细胞,并通过多次换液及BMSCs的细胞贴壁特性进行纯化。利用DMEM培养基对大鼠骨髓间充质干细胞进行原代及传代培养,并利用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定。将传代好的第三代细胞进行冻存。首先我们采用MTT法研究s FRP3及Wnt5a对鼠BMSCs增殖的影响。通过在酶标仪上测定各孔光吸收值,观察s FRP3及Wnt5a对细胞增殖的影响。接着我们研究不同浓度的s FRP3及Wnt5a对大鼠BMSCs成骨分化的影响。处理组细胞加入不同浓度的s FRP3及Wnt5a作为刺激因子,设立空白对照组,并进行成骨诱导,于第6天进行碱性磷酸酶染色,利用ELASA检测法,检测细胞胞浆中碱性磷酸酶的水平。随后我们研究s FRP3是否通过Wnt信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化。将1n M s FRP3、1n MWnt5a及1n M s FRP3+1n MWnt5a分别加入细胞孔板中,并设立对照组,进行成骨诱导,同样利用ELASA检测法,检测细胞胞浆中碱性磷酸酶的水平。并提取各组的细胞的总蛋白,利用Western blot检测各组细胞特异性抗体卷曲蛋白(Frizzled)及β-catenin的含量。结果1.s FRP3及Wnt5a对大鼠BMSCs增殖有抑制作用,随浓度的增加,抑制作用增强,细胞数目减少。2.与对照组对比,随s FRP3浓度的增加,细胞胞浆中碱性磷酸酶水平逐渐增加,各组之间进行统计学分析,P<0.05,差异具有统计学意义。3.与对照组对比,随Wnt5a浓度的增加,细胞胞浆中碱性磷酸酶水平逐渐降低,各组之间进行统计学分析,P<0.05,差异具有统计学意义。4.对1n M s FRP3、1n MWnt5a、1n M s FRP3+1n MWnt5a及空白对照组中细胞胞浆中碱性磷酸酶水平进行检测,s FRP3组>s FRP3+1n MWnt5a组>空白对照组>Wnt5a组,各组之间进行统计学分析,P<0.05,差异具有统计学意义。5.对1n M s FRP3、1n MWnt5a、1n M s FRP3+1n MWnt5a及空白对照组中胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)及胞内的β-catenin蛋白进行Western blot检测并进行半定量分析,根据蛋白电泳条带从深到浅排列,其顺序为s FRP3组、空白对照组、s FRP3+1n MWnt5a组、Wnt5a组。结论1.s FRP3及Wnt5a抑制大鼠骨髓间充质细胞增殖。2.s FRP3能促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并促进碱性磷酸酶的表达,相反Wnt5a抑制大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并抑制碱性磷酸酶的表达。3.s FRP3抑制Wnt5a从而促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并促进碱性磷酸酶的表达。4.s FRP3抑制Wnt5a引发的非经典的Wnt信号通路,从而促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。